沉香醇提物对顺铂诱导家鸽呕吐的止呕作用研究△

王灿红，彭德乾，刘洋洋，余章昕，郭鹏，3*，魏建和，3*

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所海南分所 海南省南药资源保护与开发重点实验室/国家中医药管理局沉香可持续利用重点研究室，海南 海口 570311；2.海南医学院 药学院，海南 海口 571199；3.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室/濒危药材繁育国家工程实验室，北京 100193

国产沉香为白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg.含树脂的木材，是名贵南药，为中医临床常用理气药。沉香药用已有千余年历史，有“药中黄金”之称。沉香味辛、苦，性微温，《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2015年版收录其功效为“行气止痛，温中止呕，纳气平喘”[1]。历代本草记载沉香可止呕，五代吴越《日华子本草》记载沉香可调中、补五脏、益精、壮阳、暖腰膝、止吐泻、心腹痛和气痢等[2]。明代陈嘉谟《本草蒙筌》记载沉香抑阴助阳，转筋吐泻能止，噤口痢痛可驱，散滞气[3]。中医临床广泛将其用于治疗胸腹胀闷疼痛[4]、胃寒呃逆呕吐[5]、肾虚气逆喘急[6]等证。现有临床研究显示，沉香复方制剂降逆汤[7]、沉香粉[8]、山楂沉香散[9]、止呕神贴[10]用于治疗卒中顽固性呃逆、恶性肿瘤化疗及术后所致呕吐，均有较好疗效，因此推测沉香具有温胃散寒、降逆和胃、温中止呕的作用。目前沉香防治呕吐的作用及机制尚未得到阐释。因此，本研究采用顺铂(DDP)制备家鸽呕吐模型，评价沉香醇提物的止呕作用并初步探究其可能的作用机制，为沉香止呕的深入研究及临床应用提供理论依据。

1 材料

1.1 药物

通体结香技术[11]产沉香(简称通体沉香)原料购自广东化州沉香结香种植基地，野生沉香和火烙沉香均购自广东化州，由中国医学科学院药用植物研究所魏建和研究员鉴定均为白木香A.sinensis(Lour.)Gilg.产沉香。

沉香醇提物参考文献方法制备[12]，所得通体沉香、野生沉香和火烙沉香醇提物浸出率分别为14%、10.5%和14%。根据《中国药典》2015年版[1]规定方法，分别对不同来源沉香制备的醇提物通过高效液相色谱进样进行质控检测。

1.2 实验动物

健康家鸽48只，体质量300～400 g，购自北京芳元缘养殖场，生产许可证号：SCXK(京)2014-0012。饲养于中国医学科学院药用植物研究所清洁级动物房，使用许可证号：SYXK(京)2017-0039，动物适应性饲养3 d后开始实验。

1.3 试剂

DDP(货号：232120，Sigma公司)；阳性药物甲氧氯普胺片(批号：G170101，山西云鹏制药有限公司)；5-羟色胺(5-HT)和多巴胺(DA)试剂盒(北京博胜经纬科技有限公司)；甲醛、0.9%氯化钠溶液等分别为国产分析纯。

1.4 仪器

Labofuge 400R型离心机(德国Heraeus公司)；MQX 200型酶联免疫检测仪(美国Bio-Tek公司)；CKX 41型倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；动物电子称、秒表计时器等。

2 方法

2.1 呕吐模型制备及给药

健康家鸽随机分为对照组、模型组、阳性药甲氧氯普胺组(50 mg·kg-1)、野生沉香醇提物组(相当于生药2.84 g·kg-1)、火烙沉香醇提物组(相当于生药2.84 g·kg-1)及通体沉香醇提物低、中、高剂量(相当于生药0.71、1.42、2.84 g·kg-1)组。对照组和模型组家鸽灌胃给予等体积蒸馏水，阳性药物和受试药物组分别灌胃给予相应药物20 mL·kg-1，连续给药7 d。参考文献方法制备家鸽呕吐模型，通过预实验最终确定造模剂量[13]。末次给药1 h后，除对照组外，其余各组家鸽分别腹腔注射DDP 6 mg·kg-1、10 mL·kg-1制备呕吐模型，并进行药效指标评价。

2.2 呕吐潜伏期

家鸽腹腔注射DDP制备呕吐模型后，观察并记录从注射后到第一次出现呕吐的时间，即为呕吐潜伏期。

2.3 呕吐次数及呕吐频率

家鸽腹腔注射DDP制备呕吐模型后，连续观察并分别记录0～2、2～4、4～6 h内的呕吐次数，根据公式(1)计算呕吐频率。

呕吐频率=6只家鸽6 h内呕吐的总次数/6/6

(1)

2.4 胃腺组织病理损伤观察

造模24 h后，翅静脉取血，解剖家鸽，摘取胃腺组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定，按照常规病理切片方法脱水，石蜡包埋，5 μm切片，苏木精-伊红染色，在显微镜(×100)下，观察胃腺组织血管扩张出血、炎性细胞浸润、胃腺细胞脱落及坏死等。按照以下评分标准计算胃腺组织的损伤程度：胃腺组织血管扩张出血(0～3分)、胃腺细胞脱落坏死(0～4分)及炎症细胞浸润(0～3分)，每部分损伤评分的总和作为该组织的损伤程度。

2.5 酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清中5-HT和DA水平

造模24 h，家鸽翅静脉取血后，3000 r·min-1离心15 min(离心半径11 cm)，取上清，置于-20 ℃冻存。按照试剂盒说明书操作方法，检测5-HT和DA水平。

2.6 数据处理

3 结果

3.1 沉香醇提物特征图谱及特征成分沉香四醇含量测定

不同来源沉香醇提物的特征图谱显示，通体沉香、野生沉香及火烙沉香醇提物中均含有《中国药典》2015年版规定的6个特征性成分，且沉香四醇含量达到《中国药典》2015年版标准。图中1号峰为沉香四醇，经计算质量分数分别为0.21%、0.11%和0.22%，见图1A～C。

注：A.通体沉香醇提物；B.野生沉香醇提物；C.火烙沉香醇提物。图1 不同来源沉香醇提物的特征图谱

3.2 沉香醇提物对家鸽呕吐潜伏期的影响

与模型组比较，阳性药甲氧氯普胺和通体沉香醇提物高剂量能够显著延长家鸽的呕吐潜伏期(P<0.05，P<0.01)，且通体沉香醇提物高剂量组作用与阳性药相当，优于同剂量下的野生沉香醇提物和火烙沉香醇提物，见图2。

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，图3～4同。图2 沉香醇提物对家鸽呕吐潜伏期的影响

3.3 沉香醇提物对家鸽呕吐次数的影响

与模型组比较，在造模后0～2、4～6 h，阳性药甲氧氯普胺和通体沉香醇提物可显著降低家鸽的呕吐次数(P<0.05，P<0.01)，且4～6 h通体沉香醇提物高剂量效果最显著，优于阳性药、野生沉香醇提物和火烙沉香醇提物；其中2～4 h时，各受试药物也可降低家鸽呕吐次数，但差异无统计学意义，见图3。

图3 沉香醇提物对家鸽呕吐次数的影响

3.4 沉香醇提物对家鸽呕吐频率的影响

与模型组比较，阳性药和各受试药物均可降低家鸽呕吐频率，其中甲氧氯普胺和通体沉香醇提物高剂量可显著降低家鸽呕吐频率(P<0.05)，且呈现剂量依赖性，且通体沉香醇提物高剂量作用优于阳性药和同剂量下的野生沉香及火烙沉香醇提物，见图4。

图4 沉香醇提物对家鸽呕吐频率的影响

3.5 沉香醇提物对家鸽胃腺组织病理形态学的影响

胃腺组织病理切片结果显示(见图5)，对照组家鸽胃腺组织结构清晰，胃上皮细胞排列整齐，大小均一，无血管扩张、出血及细胞坏死等病理变化，且未发现炎症细胞浸润现象。模型组家鸽胃腺组织结构严重破坏，血管扩张伴严重出血，大面积胃细胞坏死，可见大量炎细胞浸润。而甲氧氯普胺、野生沉香、火烙沉香和通体沉香醇提物均能够不同程度缓解胃腺组织的病理损伤，其中通体沉香醇提物高剂量组的效果最好，胃上皮细胞坏死、出血及炎症细胞浸润等现象均显著减轻；阳性药作用次之，野生沉香醇提物和通体沉香醇提物中剂量组效果相当，较好地改善了胃腺组织的病理损伤，火烙沉香醇提物与通体沉香醇提物低剂量组效果相当，其中仍可见胃腺组织损伤现象，胃腺上皮细胞仍有轻度出血和少量炎症细胞浸润，但细胞坏死显著减少。

注：A.对照组；B.模型组；C.甲氧氯普胺50 mg·kg-1组；D.野生沉香醇提物2.84 g·kg-1组；E.火烙沉香醇提物2.84 g·kg-1组；F.通体沉香醇提物0.71 g·kg-1组；G.通体沉香醇提物1.42 g·kg-1组；H.通体沉香醇提物2.84 g·kg-1组；I.病理损伤分数；与对照组比较，***P<0.001；与模型组比较，图5 沉香醇提物对家鸽胃腺组织病理形态学及病理损伤分数的影响(HE，×100)

3.6 沉香醇提物对家鸽血清中5-HT和DA水平的影响

与对照组比较，模型组家鸽血清中5-HT和DA水平显著升高(P<0.05，P<0.001)。与模型组比较，甲氧氯普胺和各沉香醇提物均能够不同程度降低致呕神经递质5-HT和DA水平(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，通体沉香醇提物作用呈现剂量依赖性，且高剂量作用优于同等剂量下野生沉香和火烙沉香醇提物，见图6。

4 讨论

呕吐是临床常见且难以治疗的一种症状，中医临床胃肠道病证表现为胃中气滞则胃脘胀痛，气滞上逆则恶心、呕吐[14]；西医中迷走神经刺激性疾病、胃肠道疾病、外科手术及肿瘤放、化疗等均可诱发恶心、呕吐，其中肿瘤放、化疗副作用呕吐最常见且发生率高，如DDP所致呕吐率高达90%～100%[15]，严重影响患者的生活质量和治疗效果。本研究采用腹腔注射DDP制备家鸽呕吐模型，评价沉香醇提物的止呕作用并对其作用机制进行初探。结果显示，沉香醇提物可显著抑制家鸽的呕吐反应，作用机制可能与调节神经递质分泌有关。

化疗呕吐是指化疗药物导致胃肠黏膜损伤、胃肠动力障碍或刺激胃肠道的嗜铬细胞及中枢神经系统释放5-HT、DA等神经递质和其受体结合产生神经冲动，传入呕吐中枢诱发呕吐[16-17]。中医理论亦认为，化疗药物可直中脾胃，导致脾胃虚弱、升降失常而出现恶心呕吐、脏腑胀满等症状[13，18]。甲氧氯普胺为多巴胺D2受体拮抗剂，同时对5-HT3受体也有轻度抑制作用，可作用于延髓催吐化学感受区(CTZ)中DA受体，具有强大的中枢镇吐作用；对于胃肠道的作用主要在上消化道，促进胃及上部肠段的运动、提高胃肠道括约肌张力、增加下食管括约肌张力和收缩幅度、阻滞胃-食管反流、加强胃和食管蠕动、促进胃排空、协调胃及上部小肠的功能，这些作用均可增强其止呕作用[19-20]。本研究结果显示，阳性药物甲氧氯普胺通过减少DA和5-HT释放及产生胃肠黏膜保护作用发挥止呕作用，与已有文献报道相一致。前期课题组研究表明，通体沉香醇提物可促进胃排空和肠推进，还具有显著抗胃溃疡和肠炎作用[21-22]。此外，还发现通体沉香挥发油具有显著镇静促眠、抗焦虑及抗抑郁作用，表现出较好的中枢神经抑制作用；且作用机制与调节中枢神经递质及其受体相互作用、抑制下丘脑-垂体-肾上腺素(HPA)轴及调节氨基酸、核酸和能量代谢有关[23-24]。这些发现均提示通体沉香可能通过促进肠推进、胃排空、保护胃黏膜及中枢神经抑制发挥止呕作用。本研究结果显示，DDP可诱导家鸽呕吐，模型制备成功，与已有研究报道一致[14，18]。通体沉香醇提物能剂量依赖性地延长家鸽的呕吐潜伏期，减少呕吐次数和呕吐频率，缓解DDP对家鸽胃组织的损伤，同时降低神经递质5-HT和DA的水平，发挥显著止呕作用，且作用优于野生沉香和火烙沉香醇提物。课题组前期的沉香醇提物促进胃排空、肠推进，抗胃溃疡及肠炎作用研究结果也显示，通体沉香作用相近或优于野生和火烙沉香醇提物。通过质控的结果可知，本研究所用受试药物的品质及稳定性可控，且均达到《中国药典》2015年版标准，醇提物也通过同样的提取制备方法。而药效存在差异，推测可能原因是不同结香方法所得沉香的成分存在差异，野生沉香形成需要较长时间，相同成香时间的活性成分种类和含量可能相对少，火烙沉香通过火烧钻孔的方法，可能成分发生了转化，而通体沉香是通过化学试剂诱导结香，且在短时间内结香的品质就可达到甚至超过《中国药典》2015年版标准，相同成香时间可能活性成分种类和含量会更高，而且化学诱导可能会产生新的成分。这些均可能是通体沉香醇提物药效优于其他来源沉香的原因，但具体还需作进一步研究阐释。

综上所述，通体沉香醇提物对DDP所致的家鸽呕吐反应具有显著抑制作用，且通体沉香醇提物高剂量效果与阳性药甲氧氯普胺作用相当，优于野生沉香和火烙沉香醇提物，可能的止呕机制与调节致呕神经递质分泌、促进胃肠蠕动及拮抗药物所致胃肠功能障碍等有关，但具体作用机制有待深入探究。