风轮菜地上部分1个新的三萜皂苷△

王扬，何乐毅凡，李龙宇，徐明杰，伍一炜，李永胜，褚夏燕，潘巧岭，赵田甜，叶晓霞，徐暾海*，朱寅荻*，刘铜华

1.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；2.中医养生学北京市重点实验室，北京 100029；3.中医养生学教育部重点实验室，北京 100029；4.天津红日药业股份有限公司，天津 362700；5.温州医科大学 药学院，浙江 温州 325035

风轮菜属植物约有22种，主要分布在东南亚的热带和亚热带地区[1]。风轮菜Clinopodiumchinense(Benth.) O.Kuntze又名断血流，最早记载于《救荒本草》[2]，为唇形科风轮菜属植物风轮菜的干燥地上部分[3]，是《中华人民共和国药典》2015年版记载的一种常用的传统中药材[4]。风轮菜味微苦、涩，性凉，归肝经，具有收敛止血的功效，用于治疗崩漏、尿血、鼻血、牙龈出血、创伤出血等各种出血症，被认为是中医止血良药[5]。风轮菜中含有黄酮、三萜皂苷[6]、二萜[7]、挥发油和脂肪酸[8]等类型化合物，这些成分具有抗炎、治疗糖尿病[9]、抗氧化、抗肿瘤和抗心肌缺血[10]等活性，其中黄酮和三萜皂苷类化合物是其主要活性成分，具有较好的开发利用前景。因此，本课题在前期研究基础上，对风轮菜的化学成分进行研究，从70%乙醇水溶液提取物中分离得到1个新的三萜皂苷类化合物3β，16β，23，28-四羟基-11α-甲氧基-30-醛基-齐墩果-12(13)-烯-3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-β-D-岩藻糖苷，命名为风轮菜皂苷H(clinopodiside H)。

1 材料

风轮菜购买于安徽省亳州市中药材市场，经温州医科大学药学院汪洪副教授鉴定为唇形科风轮菜属植物风轮菜C.chinense(Benth.) O.Kuntze。样品标本(20170820)现存于温州医科大学药学院。

Bruker Avance Ⅲ 600型核磁共振仪(德国Bruker公司)；LTQ-Obit rap XL型质谱仪(美国Thermo Fisher公司)；Agilent 1100型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；YMC Pack ODS-A型半制备色谱柱(250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC公司)；柱色谱和薄层色谱硅胶(青岛海洋化工厂)；D101型大孔树脂(南开大学)；C18反相填料(日本YMC公司)；Sephadex LH-20(瑞典Amersham Biosciences公司)；D-吡喃葡萄糖(批号：110833-201205，纯度>99.5%，国药集团化学试剂有限公司)；D-吡喃岩藻糖(批号：10179351，纯度>99%，Alfa Aesar公司)；所用化学试剂均为分析纯(常熟市杨园化工有限公司)；水为实验室仪器自制超纯水(杭州永洁达净化科技有限公司)。

2 提取与分离

风轮菜的干燥地上部分用70%乙醇水溶液在80 ℃提取2次，每次2 h，滤过浓缩得到乙醇提取物，加适量水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收溶剂得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物。

取正丁醇萃取物，经D101型大孔树脂分离，用乙醇-水(3∶7、1∶1、7∶3和1∶0)梯度洗脱。取乙醇-水7∶3洗脱部位经正相硅胶柱色谱分离，依次用二氯甲烷-甲醇(1∶0～0∶1)梯度洗脱，回收溶剂，经薄层色谱检视，合并相似组分得到16个部位(Fr.Z1～16)。Fr.Z12经中压反相柱色谱，以甲醇-水(3∶7～1∶0)梯度洗脱，经薄层色谱检视，合并相似组分得到8个组分Fr.Z12-1～12-8，将Fr.Z12-6经葡聚糖凝胶柱色谱和高效液相制备色谱分离纯化，得到化合物1(6 mg)。

3 酸水解

取所分离得到的化合物11 mg溶解于1 mL三氟乙酸-水溶液中，在95 ℃水浴回流2 h。冷却至室温，用等体积的二氯甲烷连续萃取3次。水层减压浓缩干燥后反复多次加入无水乙醇旋蒸除去三氟乙酸。与单糖标准品在展开系统(三氯甲烷-甲醇-水8∶5∶1)下层进行薄层色谱(TLC)检测，确定水解得到的单糖种类。用2 mL无水吡啶溶解水层样品，再加入1.5 mg的L-半胱氨酸甲酯盐酸盐，密封，60 ℃加热1 h。冷却至室温，再加入三甲基氯硅烷和六甲基二硅胺烷(1∶2，0.5 mL)，密封，60 ℃加热30 min。取单糖标准品D-吡喃葡萄糖、D-吡喃岩藻糖(各1 mg)加入1.5 mg的L-半胱氨酸甲酯盐酸盐，用2 mL无水吡啶溶解，密封，60 ℃加热1 h。再加入三甲基氯硅烷和六甲基二硅胺烷(1∶2，0.5 mL)，密封，60 ℃加热30 min。样品离心，取上层进行气相色谱分析[11]。

4 结构鉴定

1H-NMR(CD3OD，600 MHz)谱显示结构中存在化学位移为δH0.74，0.97，1.04，1.10，1.35的5个甲基单峰，1个双峰甲基δH1.26(3H，d，J=6.6 Hz)，1个醛基质子δH9.47(1H，s，-CHO)[12]，2个连氧的亚甲基信号δH3.61，3.86，4个连氧的次甲基信号。13C-APT(CD3OD，150 MHz)谱显示化合物共有49个碳信号，其中包括苷元31个碳和糖基的18个碳，苷元部分含有5个甲基(δC13.3，18.2，18.9，27.0，24.5)、2个羟甲基(δC68.2，C-28；64.7，C-23)、1个醛基碳信号(δC208.4，C-30)、2个烯碳(δC123.9，C-12；148.4，C-13)和1个连氧次甲基(δC84.4，C-3)。通过该化合物的相对分子质量、氢谱和碳谱数据分析，推断其为Δ12-齐墩果烯。通过HMBC和HSQC可知C-16的化学位移为67.37，连有1个羟基，H-16和H-27的NOE相关得到16-OH为β构型。HMBC谱显示H-24与C-3(δC84.4)、C-4(δC44.7)有远程相关，H-12(δH5.52，d，J=3.6 Hz)与C-9(δC53.1)、C-11(δC77.6)、C-13(δC148.4)、C-14(δC44.9)有远程相关，H-23与C-4(δC44.7)、C-5(δC48.4)有远程相关。在HMBC谱中H-3与C-24有远程相关，H-24和H-23都与C-4有相关，由HMBC和NOESY可知C-24连有甲基，C-23连有羟甲基。该化合物烯碳的化学位移与齐墩果烷中C-12，13是双键时化学位移值相近，故该化合物的烯碳位于12，13位，HMBC中H-12与C-11有相关，C-11的化学位移向高场位移，接有1个含氧基团，而且H-11与-OMe的碳有相关，通过HSQC可知-OMe的化学位移为δH3.28，与甲氧基的一般化学位移值接近，且峰形为单峰，故C-11位连有1个甲氧基。H-3(δH3.61)和H-5(δH1.24)，H-24(δH0.74)和H-25(δH1.10)的NOE相关得到3-H为β构型。H-11(δH3.85)和H-25，H-11和H-26的NOE相关得到H-11为β构型，由此得出苷元为3β，16β，23，28-四羟基-11α-甲氧基-30-醛基-齐墩果-12(13)-烯部分。

化合物1的核磁共振数据显示有3个糖基，分别是1个β-D-岩藻糖基和2个β-D-葡萄糖基，糖的端基碳信号为δC103.6，104.9，105.5(C-1″，1′，1‴)，由HSQC实验确定其对应的氢分别是δH4.86(d，J=7.8 Hz)、4.48(d，J=7.8 Hz)、4.60(d，J=7.8 Hz)。HMBC实验显示C-3和H-1′、H-1′和C-2′/C-3′、C-2′/C-3″和H-1″、C-3′/C-3‴和H-1‴之间有远程相关，且C-3的化学位移向低场位移，说明岩藻糖基的C-1′连接在苷元C-3位上的羟基，2个葡萄糖基分别连接在岩藻糖基的C-2′和C-3′上的羟基，在COSY谱中H-1″和H-2″、H-1‴和H-2‴有相关峰。由端基氢(δH4.48，d，J=7.8 Hz，H-1′)与附近H-2′的偶合常数确定岩藻糖为β构型，2个葡萄糖的端基氢分别为δH4.86(d，J=7.8 Hz，H-1″)和δH4.60(d，J=7.8 Hz，H-1‴)，在NOESY谱中H-1″和H-3″相关，H-1‴和H-1′相关，确定2个葡萄糖基为β构型。对化合物1进行酸水解，用气相色谱检测经半胱氨酸甲酯盐酸盐衍生化和甲基化反应的水解的糖部分，并与单糖标品比对，进一步确证糖的绝对构型为D-岩藻糖基和D-葡萄糖基。见图1～2和表1。

表1 化合物1的1H(600 MHz)和13C(150 MHz)NMR数据(CD3OD)

图1 化合物1的关键COSY和HMBC相关

综上所述，化合物1确定为3β，16β，23，28-四羟基-11α-甲氧基-30-醛基-齐墩果-12(13)-烯-3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-β-D-岩藻糖苷，命名为风轮菜皂苷H(clinopodiside H)。

图2 化合物1的关键NOESY相关

5 结果与讨论

本实验对风轮菜进行了化学成分的研究，从75%乙醇水提取物的正丁醇萃取部位分离得到1个新的三萜皂苷化合物。三萜皂苷类成分是风轮菜主要的药理活性成分。本研究为寻找风轮菜属植物中新的、高效的生物活性成分提供参考。