VEGF对小鼠急性心肌梗死后心肌细胞缺血损伤的保护作用

王朋朋，李志娟，邢适颖，张优

急性心肌梗死（AMI）是冠状动脉（冠脉）疾病最严重的表现形式，每年在美国造成200多万人死亡，在欧洲和亚洲造成400多万人死亡，在发达国家死亡人数中占比1/3以上[1]。近年来，虽然冠心病死亡率有所降低。但心肌梗死仍影响着全球700多万人，对全球健康造成严重影响。血管内皮生长因子（VEGF）是由内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞产生的信号蛋白，可增加血管通透性，刺激血管内皮细胞表达，诱导血管生成[2]。动物模型发现VEGF促进AMI梗死区域的血管生成，并减少AMI区域[3,4]。细胞在缺氧状态下诱导VEGF表达，循环VEGF与其受体结合，导致酪氨酸激酶的触发和血管的生成[2]。也有研究发现AMI发病后7 d血浆VEGF水平较高的患者长期预后较好，而较低的血浆VEGF水平是主要不良心血管事件（MACEs）的独立危险因素[5]。然而，VEGF在AMI中的作用机制尚无准确定论。本研究采用经典的左冠状动脉前降支结扎模型，探讨VEGF对急性心肌梗死后小鼠心肌缺血的保护作用。

1 资料与方法

1.1 实验药物 VEGF（Cytolab 公司，美国）。

1.2 试剂与设备 红四氮唑（TTC，美国Sigma公司）；门冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸磷酸激酶（CPK）试剂盒[均购自于北京博奥森生物技术有限公司]；免疫印迹荧光标记羊抗兔二抗IRdye@800CWlgG（LI-COR公司）；凝胶电泳系统（北京六一仪器厂）；凝胶电泳转移系统（BIO-RAD）；聚偏二氟乙烯膜（美国Millipore）；化学发光蛋白检测显影液（美国Borad）；TRhol试剂盒（Invitrogen， 15596-026）；反转录试剂盒（Roche，04896866001）；LightCycler480SYBRGreen荧光定量PCR仪（罗氏公司）；TUNEL试剂盒（Millipore公司，S7111）；荧光显微镜（OLYMPUS DX51）。

1.3 实验动物和模型建立

1.3.1 实验动物分组 选择成年雄性C57BL/6J小鼠48只，月龄8～10周，体重23.5～27.5 g（中国医学科学院实验动物研究所）。没有特定的病原体等级。 每组手术过程和实验数据分析均为单盲。在实验动物购回并适应环境1周后，将它们随机分成三组：假手术组、模型组和VEGF治疗组，每组各16只。

治疗方法：假手术组给予手术通路，但不实施冠状动脉结扎；VEGF治疗组和模型组小鼠给予手术途径，并给予实施冠状动脉结扎术。各组小鼠分别在结扎处理0.5 h后经尾静脉注射给药处理。VEGF组给予1 ml VEGF溶液（2 μg/ml，含50 U/ml肝素）处理。 另外两组给予1 ml 0.9%氯化钠溶液（含50 U/ml肝素）。本研究所有涉及动物的操作均得到我院伦理委员会批准，并遵循国家实验室动物护理和使用指南。

1.3.2 小鼠心肌梗死模型建立 通过腹膜内注射3%戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉。在加热垫上进行El气管内插管，并用啮齿动物呼吸机（Somnosuite模型； Kent公司）进行辅助呼吸。从左侧第四肋间入胸，识别左前降支走行范围。并用7-0滑线结扎左前降支。 当左心室前壁颜色变为苍白时，证实在小鼠心肌梗塞模型成功后一直维持血管结扎。 假手术组不结扎左前降支，但模型组结扎位置基本相同。VEGF组在造模成功后第二天开始以腹腔注射给药，直至14 d。

1.4 TUNEL染色检测细胞凋亡 通过TUNEL试剂盒染色，荧光显微镜下观察到与蓝核重叠的绿色荧光为凋亡细胞。 采用Image-ProPlus 6.0软件对图像进行处理和分析并根据该公式计算凋亡指数。

1.5 RT-PCR 从心脏组织中提取总mRNA，采用分光光度计对RNA的浓度和纯度进行检测，并且根据试剂盒的说明逆转录cDNA。采用 Light Cycler@480SYBRGreenlMaster检测促炎因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白细胞介素1p（IL-1p）和白细胞介素6（IL-6）mRNA表达水平。以GAPDH用作内部参考基因，并将结果与GAPDH基因的表达进行比较。 计算各组相对于假手术组的相对表达水平。

1.6 超声检测 通过Vevo770高分辨率超声成像系统在取材前进行超声检测。方法如下：在左胸骨附近采取左心室乳头肌水平短轴切面。 测量左室舒张末期内径（LVDD）、左室收缩末期内径（LVDS）、左室射血分数（LVEF）、短轴缩短率（FS），以及每搏输出量（SV）。所有指标均为3个连续心动周期的平均值。

1.7 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。不符合正态分布的测量值表示为中位数（四分位间距），组间比较采用秩和检验用于。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠超声检测结果 与假手术组比较，模型组和VEGF组小鼠LVDd和LVDd均显著升高，FS、LVEF、SV均显著降低，差异有统计学意义（P均＜0.05）。VEGF组LVDd和LVDs均显著低于模型组，FS、LVEF、SV显著高于模型组，差异有统计学意义（P均＜0.05，表1）。

表1 各组小鼠超声检测结果

2.2 各组小鼠血清中心肌酶含量比较 与假手术组比较，模型组、VEGF组血清AST、CPK、LDH均显著升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）。VEGF组血清AST、CPK、LDH 含量显著低于模型组，差异有统计学意义（P均＜0.05，表2）。

表2 各组小鼠血清中心肌酶含量比较

2.3 各组小鼠细胞促炎性因子比较 与假手术比较，模型组、VEGF组TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA相对表达明显上调，差异有统计学意义（P＜0.05）； VEGF组TNF-α、IL-1B和IL-6 mRNA相对表达量显著低于模型组（P＜0.05，表3）。

2.4 各组急性心肌梗死诱导的心肌细胞凋亡比较 与假手术组相比，模型组和VEGF组细胞凋亡明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。VEGF组细胞凋亡低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1～2）。

3 讨论

AMI仍然是全球范围内最常见的致命疾病之一[6,7]。它以心脏部分血液供应中断，导致心肌损伤为特点[8,9]。AMI患者常伴有与不良临床结局相关的多个复杂的冠脉斑块[10]。AMI后细胞凋亡和炎症等多种因素可导致缺血再灌注损伤[11-13]。因此，阐明缺血损伤心肌细胞凋亡和存活的调控机制，对减少冠状动脉突然闭塞后心肌损伤的发生具有重要意义。心肌炎症在心功能和功能障碍的病理生理机制中发挥着重要作用，机体发生过度心肌炎症会对心肌造成严重损害，最终导致瘢痕形成，发生心肌梗死[14,15]。AMI后心肌细胞局部产生的炎性介质如TNF-α、IL-1β和IL-6可能是缺血后心肌功能障碍，细胞凋亡和（或）肥大的重要原因。反过来，炎性细胞因子刺激各种信号通路，进一步控制炎症，导致恶性循环[16,17]。本研究表明，VEGF可以降低TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，表明VEGF可以减轻缺血诱导的心肌炎性反应。先前的研究发现VEGF是一种具有高度特异性的促血管生长因子，可使AMI 小鼠血管再生[18]。本研究发现，对AMI小鼠给予VEGF 治疗后，可使小鼠LVDd 和LVD显著降低，FS、LVEF及SV显著提高。此外，对AMI小鼠实施VEGF治疗后可使血清心肌酶显著降低，表明VEGF可改善AMI小鼠的心功能。既往研究发现细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤的诱因[19]。据报道，寡分裂素1通过调节心肌细胞凋亡对心肌缺血再灌注损伤起保护作用[20]。DAPT（一种gg-分泌酶抑制剂）可通过减少凋亡来保护缺血再灌注损伤[21-22]。在我们的研究中，经过VEGF治疗，AMI小鼠心肌组织细胞凋亡可获得有效抑制。为临床治疗AMI疾病提供科学依据。

表3 各组小鼠细胞促炎性因子比较

图1 各组心肌细胞凋亡TUNEL（A:假手术组；B：模型组；C：VEGF组）染色×200

图2 各组凋亡指数比较

综上所述，VEGF对AMI小鼠具有一定的保护作用，其作用机制可能与心肌功能的改善、心肌细胞炎症反应的减轻以及凋亡的减少有关。