猪细小病毒L株毒种最高代次范围及其依据

李建华，张智明，何世岷，窦海燕，方超，刘旭

（哈药集团生物疫苗有限公司研发中心，哈尔滨150069）

1 材料

1.1 毒种

猪细小病毒L株E0代，批号：PPV-E1-201301，由哈药集团生物疫苗有限公司制备、鉴定和保存；检验用强毒：猪细小病毒7909株，批号：PPV-Q-201201，规格：2.0 mL·支-1，红细胞凝集价为1:512，病毒含量107.75TCID50/mL，由哈药集团生物疫苗有限公司制备、鉴定和保存。

1.2 血清

猪细小病毒阳性血清，HI效价：1:512，规格1.0 mL·支-1；猪细小病毒阴性血清规格1.0 mL·支-1，均来源于东北农业大学。

1.3 红细胞悬液制备

0.5%豚鼠红细胞悬液，按现行《中国兽药典》附录进行制备。

1.4 主要试剂

MontanideTMISA 206 VG佐剂，购自法国赛比克公司；二乙烯亚胺，购自FLUCA公司。

1.5 无菌检验用培养基

TG（硫乙醇酸盐培养基）、GA（酪胨琼脂）、GP（葡萄糖蛋白胨汤），均由哈药集团生物疫苗有限公司提供。

1.6 支原体检验培养基

购自北京海淀中海动物保健科技公司。

1.7 试验动物

妊娠40日初产母猪（猪瘟中和抗体阴性、猪细小病毒HI抗体不超过1:8），购自黑龙江省哈尔滨市郊某猪场，品种为长白；350～400 g成年豚鼠（猪细小病毒HI抗体不高于1:8），由哈药集团生物疫苗有限公司实验动物中心提供。

2 方法

2.1 毒种的传代

将猪细小病毒L株原始毒种E0代按培养液体积0.5%的比例接种到新消化的ST细胞悬液中（2.0×105个细胞·mL-1），置37℃静置培养，每日观察1～2次。培养48 h后，收获含病毒的细胞培养液和细胞，收获的病毒液反复冻融3次，吸取部分病毒液做无菌检验。将检验无菌的病毒液作为E1代病毒液，并按以上方法在ST细胞上连续传代至E12代。每代分别留样用于检验，剩余病毒液置于-20℃冻存。取E1～E12代病毒液进行病毒含量和红细胞凝集价测定，对E1、E3、E5、E7、E9和E12代病毒液进行了毒力、免疫原性、特异性和纯净性检测。

2.2 病毒含量

将各代毒种用MEM细胞培养液作10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7 3个稀释度，各加入96孔细胞培养板，每个稀释度6孔，每孔100μL，同时设6孔加100μL MEM作为无病毒空白对照。每孔加入100μL新消化的ST细胞悬液（4.0×105个·mL-1），置37℃含5%CO2培养箱中培养5日，每日观察和记录各孔中病毒感染情况，取最高细胞病变时间点，按Reed-Muench法，计算病毒的致半数细胞感染滴度（TCID50）。

2.3 红细胞凝集价测定

将毒种作2倍系列稀释，按现行《中国兽药典》附录测定对0.5%豚鼠红细胞的凝集价。

2.4 毒力

取妊娠40日的初产母猪（猪瘟中和抗体阴性、猪细小病毒HI抗体效价低于1:8）5头，经鼻内接种2.0 mL病毒液（每mL病毒含量106.0TCID50）。攻毒后观察妊娠母猪是否产出死胎或胎，记录胎儿生长情况，并采集胎儿肝脏、肾脏、肠系膜淋巴结等组织，用PCR方法检测是否感染猪细小病毒。

2.5 免疫原性测定

将病毒液按本规程制备疫苗。用细小病毒血凝抑制（HI）抗体阴性体重350～400 g的豚鼠5只，各肌肉注射疫苗0.5 mL。28日后，连同条件相同的对照豚鼠2只，采血，测定HI抗体效价。

2.6 特异性检验

将毒种用MEM稀释成200TCID50/0.1 mL，分别与等量猪细小病毒阳性血清和猪细小病毒阴性血清混合，置37℃水浴作用1 h后，加入96孔细胞培养板6个孔内，其后每孔加入100μL新消化的ST细胞悬液（4.0×105个·mL-1）。同时设正常细胞对照，置37℃含5%CO2培养箱中培养5日。

2.7 无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验。

2.8 支原体检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验。

2.9 外源病毒检测

2.9.1样品的处理

取保存的F0代毒种3瓶，混合后用相应的的特异性抗血清中和后作为检品。

2.9.2接种的细胞与样品的培养

接种的细胞将检品接种以下细胞：Vero细胞、MDBK细胞、PK15细胞。样品的接种与培养，将1.0 mL已处理的被检样品接种到已长成单层的上述细胞，另设1瓶未接种的正常细胞对照，并培养不少于14日，其间应至少继代1次。最后1次继代的细胞单层数量和培养面积应符合荧光抗体检查法、致细胞病变检查法和红细胞吸附性外源病毒检验的要求。判定在至少14日的培养期内，要对细胞培养物进行常规检查，如果培养期间出现细胞病变即判定为不符合规定。如无细胞病变，培养结束，时，细胞单层应按2.9.3进行检验。

2.9.3检查方法

荧光抗体检查法最后1次继代的细胞单层培养5～7日后用于荧光抗体检查。对每一种特定外源病毒的检验应至少包含3组细胞：1.被检样品处理细胞；2.在最后1次继代时接种100～300 FAID50特定病毒的阳性对照细胞；3.未加样品的阴性对照细胞。每一组细胞单层检查面积应不小于6 cm2。

每一组细胞应按下列规定选择特异的抗病毒荧光抗体：①所有细胞均应检验：牛病毒性腹泻病毒（BVDV）；②猪源细胞：猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）。

细胞单层样品经甲醇定后，用适宜的荧光抗体进行染色，检查每一组细胞单层是否存在特定外源病毒的荧光。当阳性对照出现特异荧光，正常细胞无荧光时，如果被检样品出现外源性病毒特异性荧光，判为存在相应病毒污染而样品不合格。如果阳性对照组荧光不明显，或者正常细胞出现明显荧光，判为无结果，应重检。

致细胞病变检查法取经传代后培养至少7日的敏感细胞单层（每个至少6 cm2）进行检验。用适宜染色液对细胞单层进行染色。观察细胞，检查包涵体、细胞融合形成的巨细胞、局部细胞坏死脱落或其他由外源病毒引起的CPE的出现情况。如果出现外源病毒所致的特异性CPE，判为样品不合格；如果疑有外源病毒污染，又不能通过其他试验排除这种可能性时，则判为样品不合格。

红细胞吸附性外源病毒检验取经传代后培养至少7日的敏感细胞单层（每个至少6 cm2）进进行检验。以PBS（pH 7.2，下同）洗涤细胞单层2～3次。加入适量0.2%的豚鼠红细胞和鸡红细胞的等量混合悬液，以覆盖整个单层表面为准，红细胞悬液可在加入前混合，亦可以分别滴加于不同的细胞单层上。选2个细胞单层，分别在2～8℃和20～25℃放置30 min后，用PBS洗涤，检查红细胞吸附情况。如果出现外源病毒所致的红细胞吸附现象，判为样品不合格；如果疑有外源病毒污染，又不能通过其他试验排除这种可能性时，则判为样品不合格。

3 结果

3.1 病毒含量测定结果

将猪细小病毒L株E0代毒种在ST细胞上连续传代至E12代，进行各代病毒液病毒含量的测定，结果见表1。

3.2 红细胞凝集价测定结果

将猪细小病毒L株E0代毒种在ST细胞上连续传代至E12代，进行各代病毒液红细胞凝集价的测定，结果见表2。

表1病毒含量的测定结果

表2红细胞凝集价测定结果

3.3 毒力测定结果

E1、E3、E5、E7、E9和E12代病毒液进行毒力的测定。结果表明，E1、E3、E5、E7、E9和E12代病毒液均能至少引起4/5的妊娠母猪产下死胎或弱胎，且采集胎儿组织PCR检测猪细小病毒为阳性，E1、E3、E5、E7代病毒液的毒力测定结果见“猪细小病毒L株基础种子批的系统鉴定报告”，E9和E12代病毒液毒力测定结果见表3。

3.4 免疫原性测定结果

将E1、E3、E5、E7、E9和E12代病毒液，按照本规程方法制备疫苗进行免疫原性测定。结果表明，E1、E3、E5、E7、E9和E12代病毒液经灭活后制备的疫苗均能使3/4以上注射豚鼠出现抗体反应，其HI效价均高于1:64。E1、E3、E5、E7代病毒液的免疫原性测定结果见“猪细小病毒L株基础种子批的系统鉴定报告”，E9及E12代病毒液的免疫原性测定结果见表4。

3.5 特异性检验结果

将猪细小病毒L株E0代毒种在ST细胞上连续传代至E12代，将各代病毒液进行特异性检验，结果表明各代次病毒液均可被猪细小病毒阳性血清完全中和，接种ST细胞观察5日不产生细胞病变，特异，结果见表5[1-4]。

3.6 无菌检验结果

各代毒种按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，结果见表6。

表3毒力测定结果

表4免疫原性测定结果

表5特异性检验结果

表6无菌检验结果

3.7 支原体检验结果

各代病毒液按现行《中国兽药典》附录进行支原体检验，结果见表7。

表7支原体检验结果

3.8 外源病毒检测结果

荧光抗体检查法检测结果结果见表8。

表8荧光抗体法检测结果

致细胞病变法检测结果结果见表9。

红细胞吸附性外源病毒检测结果结果见表10。

表9致细胞病变法检测结果

表10红细胞吸附性外源病毒检测结果

4 结论

猪细小病毒L株E1～E12代病毒液，病毒含量为107.36～107.60TCID50/mL、红细胞凝集价在1:512～1:1 024；E1、E3、E5、E7、E9和E12代 病 毒液，毒力稳定、免疫原性良好、特异、纯净。为进一步确保L株作为生产用毒种的遗传稳定性，将其作为生产用毒种的基础代次限定为E1～E5代，生产代次限定为E6～E8代，生产毒种最高使用代次不超过3代。