益阴通络胶囊对缺血性脑卒中大鼠脑组织病理改变及神经保护作用的研究*

刘 溪，张 慧，冯思娜，李笑雨

1.陕西中医药大学第一临床医学院(咸阳712046)；2.陕西中医药大学附属医院(咸阳712021)

缺血性脑卒中(Cerebral ischemic stroke，CIS)是一种以高发病率、高致残率、高复发率为特征的脑血管疾病，在临床中占中风发病总数的60%～80%[1-2]，中风是仅次于缺血性心脏病的第二大死因，占全世界死亡人数的9%。根据世界卫生组织数据，全世界每年有1500万人患中风。其中有600多万人死亡，另有500万人永久致残，严重危害人类生命和健康[1]。因此，探索CIS的新治疗方法，促进CIS患者神经功能的恢复，降低残废率、改善预后，具有重要意义。益阴通络胶囊是陕西省名老中医杨秀清教授用于治疗缺血性脑卒中的经验方，现已开发为陕西中医药大学附属医院院内制剂使用。本方具有滋补肝肾，化痰开窍，活血通络功效，临床上主要用于治疗中风病所致肢体瘫痪、麻木、无力、头晕耳鸣、语言不利、烦躁不眠、面红口干，舌红苔少等症。本实验拟通过对缺血性脑卒中大鼠血清中一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)、血清超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、大鼠脑匀浆中Na+-K+-ATP酶活性及缺血性脑卒中后大鼠神经功能缺损症状、脑组织病理改变的实验研究来探讨益阴通络胶囊保护脑神经细胞、修复神经系统损伤的作用机制及治疗缺血性脑血管病的作用机理，为益阴通络胶囊作为治疗缺血性脑血管病的有效中药复方提供实验依据。

材料与方法

1 实验材料

1.1 实验动物：SD大鼠90只，平均体重(280±30)g，雌雄各半。由西安交通大学医学院实验动物中心提供，合格证书号：SCXK(陕)2007-001。

1.2 实验药物和试剂：益阴通络胶囊，由陕西中医药大学附属医院制剂中心提供，按每克含生药3.6 g标准制备，批号:20080104。血塞通片(云南省玉溪市维和制药有限公司生产，批号:20080206)。NOS试剂盒、SOD试剂盒、Na+-K+-ATP酶试剂盒、考马斯亮兰测定试剂盒，均购于南京建成生物工程研究所。注射用青霉素钠粉针剂(国药准字23021439，瑞阳制药有限公司)；10%水合氯醛溶液(由陕西中医药大学附属医院制剂中心提供)。

1.3 实验仪器：LD4-2型低速离心机、OLYMpUS CX31型电子显微镜、723分光光度计、FJ-2103γ免疫计数仪。

2 实验方法

2.1 脑缺血大鼠模型制备：线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型是常用的缺血性脑卒中动物模型。造模方法参照文献[2],具体操作如下：大鼠术前禁食一夜后，用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠并固定于手术台上，颈部去毛，碘伏消毒，颈部前正中线切开皮肤，沿右侧胸锁乳突肌后气管旁钝性分离颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，结扎颈总动脉近心端，并在靠近颈总动脉分叉处结扎颈外动脉，动脉夹夹闭颈内动脉远心端，并在距离颈总动脉分叉处3 mm处的颈动脉上剪开一小口，将一根头端处理过的0.33 mm直径的尼龙线从小口中插入，缓慢向颈内动脉入颅方向推进，尼龙线的插入深度距离颈总动脉分叉处约(18.0±0.5) mm左右时感到阻力，缺血后1 h拔掉线栓，缝合颈部伤口。腹腔注射青霉素4万U/d，预防术后感染，连用 3 d。假手术组不插入线栓，不闭塞MCA，其他操作同模型组。

2.2 分组及给药：空白组及假手术组各8只；造模后24 h参考Bederson评分法[3]对各组大鼠进行神经功能评分。死亡及评分小于2分的大鼠剔除，采用随机分组法将造模成功并符合入选标准的40只大鼠(90只大鼠中10只进行预实验，手术期间及术后死亡19只，模型未成功5只)分为模型组、血塞通阳性对照组(0.03 g/kg)、益阴通络胶囊小、中、大(0.21 g/kg、0.42 g/kg、0.84 g/kg)剂量组，每组8只，按1 ml/100g灌胃给药，1次/d，连续给药7 d。空白组不给予任何处理，假手术组及模型组灌胃生理盐水。给药7 d后进行指标检测。

2.3 神经功能缺损评分：在术后24 h及治疗后第8天,参照Bederson 6级5分法[3]对大鼠神经功能评分。正常为5级(0分)；不能完全伸展对侧上肢为4级(1分)；向麻痹侧的侧向推力的抵抗力降低为3级(2分)；提尾时向外侧转圈为2级(3分)；自动转圈为1级(4分)；无自发性活动、意识丧失为0级(5分)。

2.4 标本采集与指标检测：灌胃结束，以10%水合氯醛大鼠腹腔注射麻醉后心脏取血，室温静置5 min后，3000 r/min离心15 min，取血清，NOS活性测定采用NOS催化L-Arg和分子氧反应生成NO,NO与亲核性物质生成有色化合物,比色测定OD值。采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。按SOD测定试剂盒说明书进行检测，蛋白含量用考马斯亮兰法测定。取血后大鼠断头取脑，左右脑分开，左半脑用于制备脑匀浆。采用Na+-K+-ATP酶测定试剂盒，分别取2%脑组织匀浆1 ml(10%的组织匀浆0.2 ml加0.8 ml生理盐水稀释)3000～4000 r/min，离心10 min，取上清液200 μl定磷。然后再用漩涡混匀器混匀，37 ℃水浴30 min，冷却至室温，在660 nm处，1 cm光径，蒸馏水调零比色测出吸光度。按公式计算Na+-K+-ATP酶活性。

2.5 脑组织病理学检查：取血后各组大鼠开颅取脑，将右侧脑组织放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定24 h，4 ℃冰箱保存。切取视交叉后0.5 mm处至小脑前的脑组织，用磷酸盐缓冲液反复漂洗，乙醇脱水，二甲苯透明后，浸蜡包埋，切片，片厚5 μm，HE染色并在10×40光倍镜下观察各组大鼠脑组织的病理改变。具体包括：神经细胞、神经细胞树突、轴突、尼氏体的病理改变。

3 统计学方法 应用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠行为学观察 空白组、假手术组大鼠均无神经功能缺损症状。其他各组大鼠均有典型神经功能缺损症状，得分多在2～4分之间，大鼠整体上表现活动不自如、精神萎靡、反应迟缓、毛色泛黄、缺乏光泽，进食与饮水量明显减少。

2 大鼠神经功能缺损分级比较 治疗期间，空白组及假手术组大鼠无神经功能缺损症状，整体精神状态良好，活动自如，毛色白有光泽，饮水进食无异常，符合预期。模型组大鼠在造模后神经功能缺损症状明显，得分在2～4分，精神不振，活动少且迟钝，毛色偏黄无光泽，毛松散蓬乱，饮水进食较少，与假手术组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)，说明模型复制成功。各组大鼠7 d后精神状态良好，进食饮水正常，毛色光亮，神经功能缺损症状明显减轻，得分多在0～1分。与模型组比较，益阴通络胶囊小、中、大剂量组及血塞通阳性对照组神经功能缺损5级比例均高，差异具有统计学意义(P<0.05)。益阴通络胶囊大、中剂量组神经缺损评级中5级比例高于血塞通阳性对照组及益阴通络胶囊小剂量组。从大鼠行为学观察比较，可以看出益阴通络胶囊对神经功能缺损症状有改善作用，以益阴通络胶囊大、中剂量组的5级比例较高。见表1。

表1 各组大鼠治疗后神经功能缺损分级比较(只)

3 大鼠血清NOS测定结果 与假手术组比较，模型组血清NOS活性降低，差异具有统计学意义(P<0.01)，说明模型复制成功。益阴通络胶囊小、中、大剂量组及血塞通阳性对照组NOS活性较模型组升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示益阴通络胶囊小、中、大剂量及血塞通均具有升高大鼠血清NOS活性的作用。益阴通络胶囊中、大剂量组升高NOS活性优于血塞通阳性对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。与益阴通络胶囊小剂量组相比较，大、中剂量组中NOS活性升高明显，差异具有统计学意义(P<0.05)。提示益阴通络胶囊大、中剂量对脑缺血损伤治疗作用优于血塞通及益阴通络小剂量。见表2。

4 大鼠血清中SOD活性检测结果 模型组与假手术组比较，模型组血清中SOD活性降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，益阴通络胶囊小、中、大剂量组及血塞通阳性对照组SOD活性均升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。益阴通络胶囊中、大剂量组与血塞通阳性对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。与益阴通络胶囊小剂量组比较，益阴通络胶囊中、大剂量组中SOD活性更高，差异有统计学意义(P<0.05)。说明益阴通络胶囊中、大剂量均能改善脑缺血所引起的病理生理改变，且优于益阴通络胶囊小剂量与血塞通。见表3。

表2 各组大鼠血清NOS 活性比较(μmol/L)

表3 各组大鼠血清中SOD活性比较(μmol/L)

5 大鼠脑组织匀浆Na+-K+-ATP酶活性测定情况 与假手术组比较，模型组脑组织中Na+-K+-ATP酶活性显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明模型复制成功。与模型组比较，益阴通络胶囊小、中、大剂量组及血塞通阳性对照组Na+-K+-ATP酶活性均升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与血塞通阳性对照组相比，益阴通络胶囊大、中剂量组Na+-K+-ATP酶活性升高更为明显，差异具有统计学意义(P<0.05)。与益阴通络胶囊小剂量组相比较，益阴通络胶囊大、中剂量组Na+-K+-ATP酶活性升高明显，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明益阴通络胶囊大、中剂量均对脑缺血损伤的有治疗作用，优于血塞通及益阴通络胶囊小剂量。见表4。

表4 各组大鼠脑组织匀浆Na+-K+-ATP酶活性比较[μmolpi/(mgprot·hour)]

6 各组大鼠脑缺血病理学改变 比较各组大鼠脑缺血病理学改变，模型组大鼠出现不同程度的脑缺血病理改变，如神经细胞水肿、坏死、尼氏体变淡、间质充血、神经细胞轴、树突减少；而血塞通阳性对照组、益阴通络胶囊小、中、大剂量组均比模型组改变轻(图1)。

A：空白组；B：假手术组；C：模型组；D：血塞通阳性对照组；E：益阴通络胶囊小剂量组；F：益阴通络胶囊中剂量组；G：益阴通络胶囊大剂量组

讨 论

中风已成为对人们不可避免的问题，并给受害者的家庭和社会带来了沉重的负担[4]。中药可通过多种机制发挥神经保护作用，包括神经保护、抗炎、抗凋亡、抗氧化、血管保护剂、记忆促进剂、功能改善剂、毒素抑制剂等，并发掘出一系列药物，如银杏叶提取物[5]、三七[6]、绿茶提取物[7]、川芎[8]等，但同时发现许多单一提取的中药成分往往在动物实验中有效，而在临床治疗时面临疗效不佳或治疗面较窄等问题。中药的复方制剂在辨证的基础上随证加减，灵活组方，且长时间使用副作用较小[9]。本研究通过对益阴通络胶囊缺血性脑卒中大鼠血清NOS、SOD、脑匀浆Na+-K+-ATP酶活性及神经功能缺损评分、脑组织病理改变进行的研究，为临床有效用药提供理论依据。研究发现，益阴通络胶囊能改善脑缺血后大鼠神经功能缺损症状、能有效地升高大鼠脑缺血后血清NOS 活性、SOD活性、脑组织中Na+-K+-ATP酶活性，达到减轻脑缺血损伤的作用。益阴通络胶囊能减轻神经元的缺血性损伤程度，从病理证实该方对缺血再灌注后脑损伤治疗作用。

NOS是一氧化氮合成的限速酶，是调节NO含量的最重要环节[10]。NO是一种血管扩张剂，具有抗平滑肌细胞活性，保护内皮，抑制血小板粘附、聚集、白细胞粘附和趋化并具有其他抗炎特性。此外，它是一种神经递质和神经调节剂,参与脑血流的自动和化学调节[11]。SOD是体内最有效的氧自由基清除剂，它可以使CRI后产生的自由基转变为过氧化氢，再由过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶变为水，以减轻组织损伤。组织内SOD活性的高低可反映机体清除自由基的能力，与体内自由基总体水平呈负相关[12]。Na+-K+-ATP酶活动是大脑正常神经元功能的重要组成部分。研究表明Na+-K+-ATP酶可能是对抗兴奋性毒性的重要靶标，Na+-K+-ATP酶可以控制中枢神经系统细胞内Ca2+的浓度，影响神经递质释放，并防止在兴奋性毒性应激中Ca2+超载和神经元凋亡[13]。

益阴通络胶囊针对肝肾阴虚、瘀阻脑络之中风而设。方中生地黄、山茱萸为君，生地黄清热凉血，补益肝肾，涩精固脱。山茱萸味酸、涩，滋阴益血。五味子、石菖蒲、远志、茯苓为臣药，五味子收敛固涩、益气生津、补肾宁心，既能滋肾以育木，又能与生地、山茱萸相裨益。石菖蒲开窍豁痰健胃。远志安神益智，交通心神。茯苓健脾、宁心，能提高机体免疫力，为中药四君八珍之一。川芎、鸡血藤、水蛭为使药。《本草汇言》：“川芎，上行头目，下调经水，中开郁结……虽入血分，又能祛一切风，调一切气。”鸡血藤补血活血通络。《要药分剂》中记载水蛭主治为：“入肝、膀胱二经”，具有破血、逐瘀之功，有不伤正气，生新血之说。诸药合用，共奏滋补肝肾、化痰开窍、活血通络之功。血塞通，由三七总皂苷组成，具有活血化瘀、通络的作用。可以扩张血管，抑制血小板聚集，降低血浆黏度。用于脑脉瘀阻所致的中风[14]。该药用于临床多年，疗效较好。故选用此药为对照药。

本实验结果说明，益阴通络胶囊能提高脑缺血大鼠NOS、SOD、Na+-K+-ATP酶的活性，改善脑缺血后大鼠神经功能缺损症状及神经元等结构的完整性，减轻自由基损伤，阻止脑缺血性神经元损伤，促进局部微血流，改善微循环状态，保护损伤脑组织，从而发挥治疗缺血性脑卒中的作用。