基于整合药理学探讨肾复康Ⅱ号胶囊治疗肾间质纤维化作用机制*

权浩浩，程小红，杜 霞，张晓凤△

1.陕西中医药大学(咸阳 712046)；2.陕西省中医医院(西安 710003)；3.陕西省中医药研究院(西安 710003 )

近年来，慢性肾脏病(Chronic kidney disease，CKD)的发病率在全球范围内不断升高。2012年的研究显示，我国CKD发病率为10.8%[1]，这一数字说明CKD已经成为我国一个严峻的健康问题，给患者家庭和社会经济带来了沉重的负担。肾间质纤维化(Renal interstitial fibrosis，RIF)是多种肾脏疾病发展至终末期肾脏病的共同通路[2]，其主要特征是成纤维细胞的过度积累与细胞外基质沉积[3]。多项研究表明，延缓CKD患者RIF进展对保护患者残余肾功能，延缓肾功能恶化具有重要意义[4]。但RIF是一个庞杂的动态过程，目前缺乏特异性的防治措施，现代医学多以血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)及血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)、TGF-β拮抗剂/阻滞剂为主要治疗手段，但治疗效果不佳。中医药具有辨证论治、个体诊疗的鲜明特点，中药具有多靶点、靶点协同的干预效果。陕西省中医医院程小红[5]教授将宏观辨证与肾脏病理微观辨证相结合，创制益肾散结复方肾复康Ⅱ号胶囊治疗RIF。该方由山萸肉、菟丝子、熟地黄、金樱子、淫羊藿、丹参、赤芍、姜黄、黄芪、山药、王不留行、鳖甲(醋)等12味中药组成。临床应用多年，疗效较好。但中药复方具有药味多、成分复杂的特点，因此我们对肾复康Ⅱ号胶囊治疗RIF的物质基础与作用机制尚不清楚。

整合药理学( Integrative pharmacology，IP) 是研究多成分药物与机体相互作用及其整合规律和作用原理的一门学科[6]。强调“整体与局部”“体内与体外”“体内过程与活性评价”等多层次、多环节的整合研究[7-9]。与中医药的“整体观”“辨证论治”“方剂用药”的特点不谋而合。本文以整合药理学研究策略为手段，深入研究肾复康Ⅱ号胶囊治疗RIF的作用靶点，明确其作用机制，为临床应用提供理论依据。

资料与方法

1 肾复康Ⅱ号胶囊化学成分数据库的建立 基于整合药理学平台V2.0的中药材数据库依次检索肾复康Ⅱ号胶囊中对应药材,收集药物相似性得分(Drug-likeness weight)高于0.8的成分信息并依次编号，构建肾复康Ⅱ号胶囊的原始化学成分库。肾复康Ⅱ号胶囊中的药材鳖甲为鳖科动物鳖(Trionyx sinensis wiegmann)的干燥背甲,具有滋阴潜阳、软坚散结、退热除蒸之功效。鳖甲的主要化学成分为氨基酸、多糖、微量元素，具有免疫调节功能、抗肿瘤、抗肝纤维化等药理活性[10]。因其作为动物药材的特殊之处，加之整合药理学平台未收录，故暂不将其纳入研究。

2 肾复康Ⅱ号胶囊药物靶标预测 整合药理学平台(TCMIP V2.0)以ETCM数据库为基础，该平台具有中药(含方剂)靶标预测和功能分析的强大功能。靶标预测原理是基于开源软件Open Babel提取药物化学成分MACCS分子指纹信息，并将化学成分的二维结构信息与FDA批准上市药物进行化学指纹特征对比，以谷本系数(Tanimoto coefficient)定义的相似度计量方法进行相似性打分。本研究选取相似性打分值≥0.8的靶标为成分对应的潜在作用靶标，并以此作为化合物候选靶标。最后借助Uniprot数据库对靶标名称进行标准化处理，转化为基因名称，以便后续研究参考应用。

3 RIF相关基因收集 以“Renal interstitial fibrosis”作为检索词分别在疾病相关基因与突变位点数据库(Dis Ge NET)、中医药百科全书数据库(ETCM)及基因名片数据库(Gene Cards)检索、收集RIF相关基因，最后整合3个疾病数据库的基因信息，进行去重复值处理，建立RIF相关基因数据库。

4 靶标映射 将预测得到的化学成分预测靶标与RIF相关基因分别整理成Excle文件，导入Venn diagram进行靶标映射、取交集处理。

5 通路富集分析 DAVID数据库是一个强大的生物信息数据库，整合了生物学数据和分析工具，为大规模的基因或蛋白列表提供系统综合的生物功能注释信息。我们将靶标映射后得到的药物和疾病共有靶标结果整理、导入DAVID 6.8，选择“office gene symbol”，物种设置为“Homo sapiens”,基于KEGG通路数据库进行通路富集。根据文献报道的P<0.01、FDR<0.01，选取靶点数量较多的前20条通路来构建多维网络。

6 “方剂-药材-化合物-靶点-通路”网络的构建 基于上述所获得的肾复康Ⅱ号胶囊的药材、成分、靶点、通路信息，采用Cytoscape软件3.6.1构建“方剂-药材-成分-靶点-通路”多维网络，并利用自带插件Network analyzer进行分析。以文献中常用的度、介数中心度(Betweenness centrality)、紧密中心度(Close centrality)均大于平均值为依据对关键化合物及靶标进行识别，进而预测肾复康Ⅱ号胶囊治疗RIF的物质基础及分子作用机制。

结 果

1 肾复康Ⅱ号胶囊化学成分数据库构成 基于整合药理学平台(TCMIP V2.0)共收集了肾复康Ⅱ号胶囊中11味药材对应219个化合物。其中山茱萸32个、菟丝子5个、熟地黄9个、金樱子14个、淫羊藿17个、丹参37个、赤芍16个、姜黄12个、黄芪24个、山药35个、王不留行18个，进行去重复处理后得到198个化合物。

2 肾复康Ⅱ号胶囊药物靶标预测 肾复康Ⅱ号胶囊中对应198个化学成分，共预测得到6030个靶标，进行去重复值后得到1011个靶标，以此作为肾复康Ⅱ号胶囊的药物候选靶标。

3 RIF相关基因收集 通过检索Dis Ge NET、ETCM和Gene Cards数据库分别得到33个、14个、2107个RIF相关基因，整合检索结果共得到2154个基因。剔除重复后，得到2117个RIF相关基因。

4 靶标映射 将得到的1011个药物候选靶标与2117个RIF相关基因进行靶标映射，得到226个药物及疾病共有靶标。认为这226个靶点可能是肾复康Ⅱ号胶囊治疗RIF的直接作用靶点。

5 通路富集 KEGG通路富集结果显示，226个药物及疾病共有靶标共富集在138条通路上。根据P<0.01、FDR<0.01，确定了20条重要通路(图1)，并以这20条通路为基础来构建多维网络。

图1 KEGG通路富集结果图

6 “方剂-药材-成分-靶点-通路”网络的构建与分析 根据方剂、药材、成分、靶点、通路信息构建肾复康Ⅱ号胶囊“药材-成分-靶点-通路”多维网络(图2)。该网络有456个节点，红色四边形节点代表肾复康Ⅱ号胶囊，菱形节点表示药材有11味，三角形节点表示疾病和药物共同有化合物198个，圆形节点表示疾病和药物共同靶标有226个，矩形节点表示关键通路有20条。边有1822条，代表各节点之间的相互作用关系，表示药材和化合物或化合物和靶标，或靶标与通路之间的联系。借助Cytoscape软件中的“Network analyzer”插件对网络进行分析，以度、介数中心度、紧密中心度均大于平均值为依据对关键化合物及靶点进行识别，得到37个关键成分，36个关键靶点，选取度值较高的部分节点进行展示，见表1、2。SFK043(Adenosine，腺苷)、SFK005(Palmitic Acid，棕榈酸)、SFK017(Ursolic Acid，熊果酸)、SFK075(Oleanolic Acid，齐墩果酸)、SFK059(Stearic Acid，硬脂酸)、SFK033(Quercetin，槲皮素)、SFK034(Kaempferol，山奈酚)、SFK002(Linoleic Acid，亚油酸)、SFK090(Baicalin，黄芩苷)、SFK058(Linolenic Acid，亚麻酸)、SFK081(3-O-Acetyloleanolic Acid，3-O-乙酰齐墩果酸)、SFK061(Kaempferitrin,山柰甙)等12个化合物自由度均大于20。雄激素受体(Androgen receptor，AR)、糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor，NR3C1)、核因子NF-κB p105亚基(Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit，NFKB1)、芳烃受体(Aryl hydrocarbon receptor，AHR)、维生素D3受体(Vitamin D3receptor，VDR)、雌激素受体(Estrogen receptor，ESR1)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)等7个靶标的自由度值均大于30。我们认为这些度值较高的化合物可能是肾复康Ⅱ号胶囊治疗RIF的主要药效成分，度值较高的靶标可能是肾复康Ⅱ号治疗RIF的重要靶标。另外，网络分析发现单味中药可对应多个化合物，同一化合物可与多个靶标具有相互作用关系，同一靶标可富集于不同的信号通路上，这一现象说明了中药治疗疾病"多成分、多靶标、多通路、靶点协同"的作用特点。

图2 “肾复康Ⅱ号胶囊-药材-成分-靶点-通路”网络图

表1 肾复康Ⅱ号胶囊主要活性化合物信息

表2 肾复康Ⅱ号胶囊关键靶标信息

讨 论

肾复康Ⅱ号胶囊以益肾散结为组方原则，切实符合RIF“肾虚血瘀”的核心病机。方中淫羊藿、菟丝子、金樱子、熟地黄、山萸肉、山药、黄芪同用，共奏温补肾阳，助阳化气之效；配伍丹参、赤芍、姜黄、王不留行、鳖甲(醋)，消瘀化痰散结；标本兼顾，扶助正气，祛除瘀血积滞，共奏益肾活血之效。

通过构建益肾散结复方肾复康Ⅱ号胶囊 “药材-成分-靶点-通路”的多维网络后发现，SFK043、SFK005、SFK017、SFK033、SFK034等化合物自由度最高。且存在不同药材对应同一种成分，一个靶标对应多个化合物的情况。我们认为上述成分可能是该复方的主要药效成分，相关研究也表明上述成分可通过不同机制干预RIF。其中腺苷可激活A1受体，通过抑制肾脏炎性因子表达、肾髓过氧化物酶激活等途径干预RIF的进程[11]。熊果酸与齐墩果酸是一对同分异构体，属五环三萜类化合物，具有抗糖尿病、抗炎及变态反应、调脂抗肥胖等作用[12-14]。TGF-β1是经典的促纤维化因子，过度表达可导致肾小球系膜细胞增生，基底膜增厚。而文献报道熊果酸含药血清可通过下调 TGF-β1表达，抑制炎症状态下系膜细胞增殖[15]。槲皮素、山奈酚属于黄酮类化合物，其中槲皮素能够通过抑制MCP-1、PAI-1和Col-Ⅰ的表达而部分逆转TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞细胞外基质的积聚[16]，可显著抑制系膜细胞增殖，使系膜细胞维持在相对稳定的状态[17]。山奈酚可缓解高糖诱导的糖尿病肾病大鼠肾组织病理性损伤,抑制细胞凋亡和炎症反应[18]。

在“方剂-药材-成分-靶点-通路”网络中自由度较高的靶点有AR、NR3C1、NFKB1、AHR、VDR、ESR1、TNF、CASP3等。其中雄激素受体属于核受体超家族成员，与雄激素结合后参与血压、血糖、血脂及人体内皮功能的调节[19]。肾小管间质纤维化程度是反映肾功能下降严重程度和判断疾病预后的最重要指标，炎症是其主要的发病机制[20]。TNF-α是浸润细胞产生的重要的促炎因子，可以刺激肾小管上皮细胞产生趋化因子，招募炎症细胞，诱导肾小管上皮转分化或凋亡[21]。糖皮质激素受体,是配体依赖的转录活化因子，有α、β两种亚型，而糖皮质激素主要与α结合发挥抗炎、抑制免疫炎症等作用。NF-κB是由转录因子p65与转录因子p50构成的二聚体蛋白，是调节各种基因表达的转录因子，具有“开关效应”。在正常肾小球细胞、肾小管上皮细胞中表达，在异常活化状态下，可促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。

图1显示富集靶点数量最多的是PI3K-Akt信号通路。该通路是胰岛素信号传导的主要途径，也是调控、维持血糖平衡的主要信号通路。HIF-1信号通路与缺氧、贫血、炎症的发生、发展密切相关。 cAMP信号通路，称为第二信使，是细胞内非常重要的信息传递通路，对于胞外信息具有迅速传递和信号放大的特点。

综上，本研究整合药理学研究策略与方法，挖掘到复方中11味药材中198个成分及1011个靶标，2117个疾病相关基因，得到226个共有靶标，并行KEGG通路富集，最后通过构建、分析“药材-成分-靶点-通路”网络。初步预测到肾复康Ⅱ号胶囊可能通过调节AR、NR3C1、NFKB1、AHR、VDR、ESR1、TNF、CASP3等靶点，调控PI3K-Akt 信号通路、cAMP 信号通路、Rap1 信号通路、HIF-1 信号通路等。通过干预炎症反应、氧化应激、调节血压、血糖和血脂发挥对于RIF的治疗作用。