鸡传染性支气管炎病毒分离与鉴定

荆丽珍 冯强 李宝华

（1，山东省海阳市畜牧兽医站 265100；2，烟台丹富仕饲料有限公司 264000；3，山东省农广校海阳市分校 265100）

鸡传染性支气管炎是属于病毒感染而引发的急性和高度传染性疾病[1]。因为本病是病毒性疾病,一旦爆发无特效治疗药物,易继发其他疾病继续突变新菌株,使免疫鸡和未免疫鸡都能检测出传染性支气管炎病毒[2]。因此,加强对禽类疾病防控中传染性支气管炎病毒研究具有重要意义。本试验经过发病肉鸡的组织分离检查、组织碾磨液注射鸡胚盲传,血凝实验和荧光PCR 检测等辨别鉴定手段来确定养鸡场的疑似传染性支气管炎毒株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料

病料取自某大型养鸡场,经过驻场兽医初步诊断疑似鸡传染性支气管炎的病鸡肺脏、气管、肾脏。

1.1.2 鸡胚,鸡红细胞

用于检测病毒血细胞凝集活性。

1.1.3 主要试剂

鸡传染性支气管炎病毒实时荧光定量PCR 检测试剂盒、PetNAD 核酸萃取试剂盒。

1.1.4 主要仪器

高压锅,DYY-11131A 型电泳槽,微型离心机,电热恒温培养箱,PCR 基因扩增仪,微型漩涡混合仪,台式高速冷冻离心机,生物安全柜。

1.2 方法

对送检病鸡的病料的采集和处理提纯组织上清液用移液枪注入无菌离心管中备用。通过病毒的增殖与纯化及病毒的RTPCR 检测确定毒株性质。

2 结果与分析

2.1 病鸡剖检结果分析

在洗消室对送检病鸡剖检对传支易感肺、肾、气管等器官剪开看有无栓塞和花斑肾。剖检结果：病鸡肾脏极度肿大,颜色苍白,呈花呈花斑样,在气管、支气管内有淡黄色黏液性渗出物,个别病鸡有黄色干酪样栓子,气囊浑浊、肾脏极度肿胀、颜色苍白,有尿酸盐沉积呈花斑样,符合IBV 的临床特征。

2.2 病毒RT-PCR 检测结果分析

病料核酸检测结果曲线接近IBV 阳性对照曲线,病毒CT值接近阳性对照,其中4 号样品CT 值小于阳性对照,毒力最强,其余检测项目病毒均为阴性,确定该病是由传染性支气管炎病毒感染造成。

2.3 传代鸡胚尿囊液的血凝检测结果分析

1%鸡血红细胞与收取每代鸡胚尿囊液做血凝实验,反应均呈阴性,每代鸡胚尿囊液均不能使鸡外周血红细胞发生凝集。这表明鸡胚尿囊液中不含有其他能使鸡外周血红细胞凝集的病毒。

2.4 传代鸡胚尿囊液的荧光PCR 检测结果分析

尿囊液PCR 检测结果显示IBV 阳性,其余能检测到其他病毒均为阴性,诊断该病造成的感染由鸡传染性支气管炎病毒所至[3]。

2.5 鸡胚病变情况

病料除菌接种鸡胚后,24h 内无鸡胚死亡。存活的鸡胚病变情况表现为鸡胚大腿及尾部有点状出血,有的呈弥漫性出血；胎儿生长阻滞、蜷缩、皮肤出血点明显等。对照胚无肉眼可见病变。有的鸡胚羊膜增厚,紧贴鸡胚,部分鸡胚肾小管、输尿管有白色尿酸盐沉着,尿囊液中有白色的尿酸盐结晶。卷曲胚胎是IBV 感染鸡胚胎的特征性症状。确定其为传染性支气管炎病毒引起的感染[4]。

综上所述：本试验通过完整系统的检测,从驻场兽医的初步对病鸡的饮食,生理状况及病鸡形态外观的变化初步做出诊断,及时送至实验室进一步检查,到对病鸡的实验室诊断严谨细致,符合国际标准。创新的核酸提取方法不仅高效而且省钱,为养殖业的疫病检查推广提供了很好的借鉴方法,能有效加强疫病的机制更快更准确地诊断出病原,消除疾病并降低检查成本。

3 讨论与小结

分离毒株的有鸡传染性支气管炎病症,如呼吸道症状和“斑点肾”。病毒稀释液接种SPF 鸡蛋胚体表现为长发育障碍、胚胎弥漫性出血和典型的卷曲胚胎[5]。对IBV 传代鸡胚尿囊液的血凝活性测定未检出病毒的血凝活性。提示尿囊液中无阳性黏附和副粘病毒。通过收集到的鸡胚尿囊液用荧光PCR 定量检测除测到传染性支气管炎病毒外其他检测项目均为阴性[6]。

根据临床症状、病理变化及鸡胚特点,本次分离出的禽传染性支气管炎病毒为鸡传染性支气管炎病毒。