miR-22和miR-156在多发性骨髓瘤中的表达分析及临床意义

汪方园，孙 岩，张 维，武 杰，银广悦

(河北中石油中心医院检验科，河北廊坊 065000)

癌症是由渐进性的基因组畸变产生的，最终赋予癌细胞疯狂生长的优势[1-2]。多发性骨髓瘤(MM)是一种血液系统恶性肿瘤性疾病，MM约占血液恶性肿瘤的10%，随着老龄化加重，MM发病人数逐渐增加[3-4]。肿瘤细胞中的DNA损伤修复机制的改变可能与疾病的发展和进展有关[5]。DNA连接酶Ⅲ(LIG3)基因编码多种DNA连接酶亚型，细菌特异性LIG3可变剪接机制生成LIG3 β参与减数分裂重组和(或)单倍体精子中DNA的修复，体内和体外的试验已证明，敲除LIG3会影响MM细胞的生存能力，可见肿瘤细胞依赖于LIG3-driven修复[6]。近期研究发现，microRNAs(miRNAs)参与了骨髓瘤细胞生长和生存的调节作用[7]，主要在转录后水平负性调控靶基因的表达。miRNA与肿瘤的发生也密切相关，很可能是一类潜在的癌基因[8-9]或抑癌基因[10]。

miRNA在MM中研究的文献报道甚少。本研究探讨miR-22、miR-156在MM发生、发展中可能的调控作用及临床意义，为发现新的MM预后指标及进一步研究miRNA在MM发病机制中的作用打下基础。

1 资料与方法

1.1一般资料 征集2017年9月至2019年4月经本院血液内科诊断及治疗并自愿参试的MM患者105例。纳入标准：(1)经常规检查、骨髓细胞学检查、骨ECT、骨髓象分析等确诊为MM；(2)首发患者；(3)年龄超过65岁。排除标准：(1)临床资料不全；(2)合并其他肿瘤患者或自身免疫疾病或重要器官衰竭患者；(3)接受过放化疗患者。依据欧洲骨髓移植协作组标准，将MM患者分为：完全缓解(血液、尿液的免疫固定电泳M蛋白为阴性，浆细胞水平<5%，发生溶骨性病变的数目和大小没有继续增加，细胞瘤消失)、接近完全缓解(免疫固定电泳可检测到M蛋白，其余指标同完全缓解)、部分缓解(血清中M蛋白减少>50%，24 h尿轻链降至200 mg，软组织浆细胞瘤大小减少幅度>50%，发生溶骨性病变的数量和大小没有继续增加)、微小缓解(血清M蛋白水平减少25%～49%，24 h尿轻链水平大于200 mg)、无变化(介于微小缓解与病情进展之间)及病情进展(血、尿M蛋白水平上升幅度>25%)。MM患者根据治疗情况分为3组：初治组(32例，男15例，女17例，年龄65～72岁)、难治组(43例，包括微小缓解、无变化及病情进展的患者，其中男21例，女22例，年龄65～72岁)、缓解组(30例，包括完全缓解、接近完全缓解、部分缓解的患者，其中男16例，女14例，年龄65～72岁)。同时，征集门诊诊断为非恶性血液病患者30例作为对照组，其中男13例，女17例，年龄65～72岁。对照组排除：急、慢性白血病患者，MM患者，巨球蛋白血症患者，淋巴瘤患者，骨髓增生性疾病患者(骨髓增生异常综合征、原发性血小板增多症、真性红细胞增多症、原发性骨髓纤维化症)。4组患者性别、年龄对比差异无统计学意义(P>0.05)。本研究参照张之南等[11]主编的《血液病诊断及疗效标准》(第三版)判定疗效。

1.2仪器与试剂 Trizol试剂购自开根生化科技(北京)有限公司，反转录试剂盒购自江苏科晶公司，实时荧光定量PCR(qPCR)仪购自北京科宇科技公司，cDNA合成试剂盒购自ThermoFisher公司。

1.3方法

1.3.1细胞总RNA提取及cDNA的合成 收取以上各组患者的骨髓液，参照天根试剂盒中方法步骤提取总的RNA，参照ThermoFisher公司cDNA合成试剂盒中的方法将miRNA和mRNA反转成cDNA后冻存，用于检测miR-22(F：GGCTGAGCCGCAGTAGTTCT；R：GTGCAGGGTCCGAGGT)和miR-156(F：TTACCGTGCTCACTCTCTT；R：GTGCAGGGTCCGAGGT)及LIG3的表达水平。

1.3.2miRNA定量引物的设计 miRNAs序列较短，大约有22个bp，miRNA的前体往往会有一段颈环结构，其序列为GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC[12]，可以根据这一结构将miRNA反转成cDNA，在qPCR检测miRNA时，上游引物为miR序列，下游引物互补环部序列，可以通用。表达内参用U6RNA，内参检测引物序列如下，F：CTCGCTTCGGCAGCACA；R：AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.3.3定量分析 参照qPCR试剂盒说明书完成qPCR体系的配置，体系如下：2 μL的miRNA第一链cDNA，25 μL的2×miRNA qPCR premix，浓度为10 mol/L的正向引物、反向引物分别加入5 μL，利用RNase-Free Water补齐到50 μL，在qPCR仪上进行扩增和荧光信号检测。根据反应后的扩增曲线和溶解曲线来判断反应质量，用2—ΔΔCt法计算miR-22，miR-156的表达水平，Ct值为扩增产物量达到临界阈值时所需的循环数，并进行统计分析。

1.3.4蛋白免疫印迹(Western blot) 利用Western blot技术检测各组患者骨髓中LIG3蛋白水平。

1.3.5荧光素酶报告基因检测 LIG3原始启动子(WT)和突变启动子(MT)与双荧光素酶链接，再将这两种质粒分别与miR-22和miR-NC(阴性对照)共同转染HEK293T细胞，每组设15个重复。转染48 h后，按照Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega公司)的说明书进行双荧光素酶的检测。按照如下计算公式计算标准荧光素酶活性：标准荧光素酶活性=萤火虫荧光值/海肾荧光值。

2 结 果

2.14组miR-22、miR-156表达水平比较 对照组、初治组、难治组、缓解组的miR-22表达水平两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-156表达水平比较，初治组、难治组与对照组，难治组、缓解组与初治组，缓解组与难治组之间的差异均有统计学意义(P<0.05)，而缓解组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 4组miR-22、miR-156表达水平比较

2.24组患者骨髓液细胞中LIG3的mRNA及蛋白表达水平比较 MM患者中LIG3 mRNA的表达水平高于对照组(P<0.05)，难治组中LIG3 mRNA(2.60±0.28)及蛋白表达水平在4组患者中最高。见图1。

注：A为4组细胞中LIG3 mRNA的表达水平；B为4组细胞中LIG3蛋白表达水平。

2.3LIG3 mRNA、miR-22、miR-156的表达水平与MM临床病理特征的相关性分析 MM患者骨髓中LIG3 mRNA、miR-22、miR-156的表达水平与病理分级有相关性(P<0.05)，LIG3 mRNA的表达水平与MM病理分级呈正相关，miR-22、miR-156表达水平与MM病理分级呈负相关，而LIG3 mRNA、miR-22、miR-156表达水平与性别、年龄无相关性。见表2。

2.4miR-22、miR-156表达水平与LIG3 mRNA表达水平的相关性分析 miR-22的表达水平与LIG3 mRNA的表达水平呈负相关，miR-156的表达水平与LIG3 mRNA的表达水平无相关性。见图2。

2.5miR-22表达水平对LIG3转录水平的影响 利用体外荧光素酶分析系统分析miR-22表达水平对LIG3转录水平的影响可见，在正常LIG3的启动子中，miR-22抑制了LIG3的表达；但是将LIG3启动子突变后，miR-22对LIG3的表达没有影响。见图3。

表2 LIG3、miR-22、miR-156的表达水平与MM临床病理特征的相关性

注：A为miR-22与LIG3 mRNA表达水平的相关性；B为miR-156与LIG3 mRNA表达水平的相关性。

图3 miR-22对LIG3转录的影响

3 讨 论

MM的发病率为10%～15%，属于造血系统的恶性肿瘤[13]，目前对其发病机制的认知较少，认为遗传学改变和细胞因子会引起MM的发生。

肿瘤细胞有一个很明显的特征，深部基因组不稳定，这一点会造成恶性浆细胞的异常增殖[14]。基因组的不稳定会导致DNA受损，所以癌细胞中的DNA损伤修复机制非常重要，DNA损伤修复机制的改变可能与疾病的发展和进展有关。本研究考察了患者的临床病理特征，检测了患者体内LIG3 mRNA及蛋白的表达量，通过相关性分析发现，LIG3在高度恶性的患者体内表达水平最高，说明LIG3的蛋白水平是由mRNA决定的，同时LIG3的表达水平与病情有一定的相关性。LIG3可以作为一个判定MM病理情况的一个指标。

miRNA是一种基因组编码长度约20～23个核苷酸的非编码mRNA，在生物体内不编码蛋白，它有多种靶基因，参与了基因的转录水平的调控，可能是骨髓瘤的致病因子。生物体内的miRNA具有多种负性调控基因表达的作用，与靶基因的mRNA的3′端(非编码区)UTR区不完全配对，改变了mRNA的表达水平[15]。miRNA参与了细胞生长发育不同阶段的时序调控、细胞增殖、细胞分化和代谢等多方面。近年来有研究发现，miRNA和肿瘤的发生有一定的相关性[8]，已有研究发现乳腺癌患者的miR-21水平与乳癌转移密切相关[12]，说明miRNA的表达量与生物体癌症的发生有着密切的关系。本研究发现，MM细胞中，抑制了miR-22的表达量，从而促进LIG3的表达翻译，保证了MM细胞基因组的稳定性，有利于其分裂生长。MM组织中miR-22、miR-156的表达量与病理分级呈负相关，而miR-22能够结合LIG3的启动子降低LIG3的表达；低表达量的miR-22确保了骨髓瘤细胞中LIG3的表达量，有利于MM的增殖。由此可见，miR-22能够结合LIG3的启动子调控LIG3的转录，从而影响骨髓瘤的发展。

4 结 论

miR-22、miR-156的低表达和MM的发生有关。miR-22通过调控LIG3的表达影响骨髓瘤的增殖，而miR156与LIG3之间没有相关性，它可能通过调控其他因子影响骨髓瘤的增殖。本研究对miRNA在MM中的作用机制研究尚不够深入，但miR-22有可能作为治疗MM的靶标基因在临床上应用。