影响食用菌菌种质量的因素及提高菌种质量的方法

岳万松，华 蓉，刘绍雄，李雪松，杨珍福，罗孝坤

(1.云南省供销合作社科学研究所，昆明 650221；2.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，昆明 650221)

我国是食用菌生产大国，据中国食用菌协会统计[1]，2018年全国食用菌总产量多达3 842.04万t，产值达2 937.37亿元。国内现有可栽培的食药用菌达105余种，种类结构不断优化，近年来食用菌产业不断发展壮大，已成为国内多个贫苦地区助推乡村振兴一个重要的支柱产业[2]。菌种是食用菌栽培生产过程的源头，其质量直接影响食用菌的产量和品质，在食用菌的栽培生产中，即便是采用优质食用菌品种生产，也会因人为造成的不良生长条件、传代次数、菌种菌龄、无菌操作水平等因素，导致菌种出现杂菌感染、老化甚至种性退化问题，具体表现为菌丝生长缓慢、长势细弱稀疏、菌种培养周期长、抗杂能力差、后续不易出菇或出菇后子实体农艺性状变差等，严重影响食用菌生产的稳定性和均一性，阻碍了食用菌产业的健康发展，给食用菌生产企业造成巨大的经济损失。这已成为食用菌产业健康发展中不可忽视的问题[3]。

1 影响食用菌菌种质量的因素

食用菌菌种相当于其它作物生产中的种子，其质量主要受食用菌自身的遗传特性、外界的生长条件及人为操作等几个因素所控制。内部因素主要是由菌种自身的遗传特性所决定，外界因素主要包括营养条件(培养基配方及其成分配比、酸碱度及含水量等)和培养条件(温湿度、通风、光照等)。

1.1 遗传因素

遗传物质是影响食用菌菌种质量的最重要因素之一。李亚娇等[4]认为，在食用菌生长过程中，会出现菌种异核现象，这可能会导致菌种发生遗传变异(核型改变)。谭琦等[5]通过实验印证了这个假设，退化的蛹虫草菌株为同核体交配型基因，不能形成子实体，而未变异菌株则为异核体交配型基因。李美娜等[6]等利用分子生物学的方法分别分析了蛹虫草野生驯化菌株和退化菌株，结果发现二者基因存在明显差异。胡锋黎等[7]探讨草菇细胞核不对称分裂与菌种退化的相关性，结果表明，草菇细胞核不对称分裂可能是引起其菌种退化的一个重要遗传因素。

1.2 生长条件

1.2.1营养因素

外界因素特别是营养成分会影响真菌异核体核的配比和分解，在菌种培养过程中出现营养不良时，比如培养基不适合菌株生长，培养料碳氮比不合理将会导致菌株的遗传物质合成受阻，影响菌丝生长速度及生长势[8-11]，最终导致栽培出菇的子实体农艺性状及品质变差[12,13]。在菌种发菌过程中，菌丝需分泌木质素酶、纤维素酶、漆酶等分解酶才能分解利用培养基质，而这些分解酶的活性由培养料的pH值所左右，不同种类食用菌对pH值要求也不同，过酸或过碱均会影响酶活性，导致新陈代谢减慢或停止[14]。黄敏敏等探究了酸碱度对菌丝生长发育的影响，结果表明，pH对菌丝直径及锁状联合的数量及表面结构有一定的影响[15]。另外，培养料含水量过低，菌丝因缺少水为介质，对培养基的降解能力减弱；培养料含水量过高，受重力作用，菌袋(瓶)下部份水分偏大，透气性低，菌丝会缺氧导致呼吸作用下降，菌丝偏弱，营养生长不良[16]。综上，培养基状况包括培养基配方及其成分配比、酸碱度、含水量等都是影响菌类菌种生长繁殖的重要因素。

1.2.2培养环境

人为造成的不良环境条件，如高温、高湿、通风不良、强光等也是影响菌种质量的因素[16]。食用菌作为一种大型真菌，其细胞被紧密的细胞壁包围，以保护它们不受有害环境条件的影响并抵抗溶解，高温是一种重要的非生物胁迫，会破坏菌丝细胞的结构完整性、影响菌丝的抗杂能力，有研究表明，平菇菌丝在36 ℃高温胁迫下，菌丝细胞壁结构趋于收缩或扭曲，细胞壁空隙率增加，经高温处理后的平菇菌丝抗逆性变差，更易受到木霉菌的感染[17]。食用菌在营养生长阶段需要充足的氧气和适宜的湿度。刘秀明等[18]以刺芹侧耳为材料，探究高温胁迫对其菌丝生长及其抗棘孢木霉能力的影响，试验发现供试PDA培养的菌丝经高温胁迫后，顶端菌丝细胞长度、直径、菌丝体分支频率和菌丝生长速率等均呈现不同程度的降低。长满菌丝的菌棒经高温胁迫(35 ℃，7 d)后，接种棘孢木霉菌丝的侵染率为100%，接种棘孢木霉孢子的侵染率为30%；未经高温胁迫的菌棒，接种棘孢木霉菌丝/孢子，未发生侵染，可见高温胁迫导致刺芹侧耳菌丝抗棘孢木霉的侵染能力明显下降。另外，高温高湿环境容易造成培养室滋生各种霉菌，与培养菌株争夺营养，导致菌种不纯；或者侵染菌株，导致菌丝无法继续生长发育[19]。食用菌菌丝从营养阶段向生殖阶段转变时需要一定的光照，光不仅能调控菌类生理周期、形态变化和代谢产物，还能促进菌类原基分化和子实体生长，但是目前普遍认为多数菌类的菌种培养阶段(营养生长阶段)不需要光诱导，若培养环境光线过强，反而会抑制食用菌的无性生长[20]。蓝光抑制平菇菌丝生长，强光对茶树菇和凤尾菇的菌丝生长不利，并且会导致菌种发菌还未完成就现蕾出菇的现象[21,22]。

1.3 其它因素

菌种菌龄。菌龄过大引起菌种出现老化或自溶现象，这类问题在食用菌液体菌种培养中尤为突出，液体菌种单次培养时间一般在5～7 d，培养好后要紧接着使用，若培养时间过长，则容易导致菌丝分泌的多种酶的活性降低[23]，并产生一些阻碍菌丝生长发育的有害物质，导致菌丝细胞衰老破裂[24]。固体菌种菌龄太长，同样会出现菌种萌发能力下降，菌丝细胞胀大、细胞壁变形等菌种老化现象。王博[25]通过试验证明，接种菌龄30 d与接种菌龄150 d的试管菌种到平皿培养基中，二者相比，前者的菌丝生长速度(1.8 cm/d)、萌发时间(1.5 d)明显优于后者菌丝生长速度(0.96 cm/d)、萌发时间(5 d)；双孢蘑菇菌种在培养50～60 d后开始老化，且菌龄与老化程度呈正相关，最终菌丝细胞壁膨胀甚至破裂瓦解。李利梅[26]研究分析了菌龄对红托竹荪菌种菌丝生长发育的影响，试验表明，漆酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶活性随菌龄的增大而明显下降，菌丝萌发力及生长速度随着菌龄增大而明显下降，菌龄90 d时，菌丝完全溶解，塌陷形成老化菌皮。

病原体侵染性病害。培养基灭菌不彻底，接种室、培养室在使用前消毒杀菌不彻底，无菌操作技术不熟练等人为因素都会造成接种后的菌种感染杂菌[27]，深绿木霉、侵占木霉、病毒、细菌等病原体，导致菌丝体无法继续生长发育，轻微时会导致菌丝生长速度变慢、菌落形状不规则，局部伴有缺刻或菌丝紊乱等；严重时则出现萎缩、褪菌和凋亡等现象[28-30]。

2 提高食用菌菌种质量的处理方法

2.1 创造适宜的生长条件

2.1.1适宜的营养条件

根据食用菌的生产方式及其质量控制的需要，我国食用菌菌种实行一级种(母种)、二级种(原种)和三级种(栽培种)的三级繁育体系[31]。提供和满足菌类生长发育的营养需求是保证菌种质量的前提，选用合适的培养基才能最大限度地保证菌丝进行正常的代谢活动，避免遗传物质合成受阻，进而导致种性退化。碳源和氮源是食用菌培养基最主要的两个成分，其中，碳源是主料，生产中常用葡萄糖、蔗糖、淀粉、木屑、棉籽壳、玉米芯、稻草、农作物秸秆等。氮源是辅料，生产中常用蛋白胨、酵母粉、麦麸、黄豆粉等。通过添加石膏、石灰、磷酸二氢钾、硫酸镁可补充矿质营养。一般使用常规的PDA培养基即可完成多数菌类的母种扩繁[16]。原种与栽培种的配方一般类似，可使用多种培养基制作，在实际生产中，适合侧耳属菌类、金针菇、猴头菇、黑木耳、香菇等多数木腐菌生长的原种/栽培种培养基有棉籽壳培养基、木屑培养基、棉籽壳木屑培养基、棉籽壳玉米芯培养基、枝条培养基或胶囊菌种等[32-38]；适合双孢蘑菇、草菇、大球盖菇等多数草腐菌生长的原种/栽培种培养基有谷粒培养基、粪草培养基、稻草培养基、秸秆培养基等[39-42]。近年来新兴的液体菌种具有活力高、萌发快、菌龄一致、培养周期短等优点，在多数菌类的原种制作中均得到了广泛应用[43-45]。

不同菇种的生物学特性一般不同，在进行人工培养菌种时，需要根据栽培菇种的特性，将培养基碳氮比、酸碱度及含水量等控制在特定范围内，才能对食用菌菌丝及子实体的生长发育有积极的促进作用。张一帆探讨了栽培配方的碳氮比与灰树花菌丝体生长的相关性，结果表明，灰树花菌丝的生长速度与碳氮比呈正相关，碳氮比71.39∶1时，菌丝生长最快[9]。王庆武等对黑木耳菌丝培养特性进行了研究，结果表明在pH值为6～7，碳氮组合为玉米粉1%，葡萄糖2%，酵母膏0.1%，牛肉膏0.4%时，菌丝生长快，长势好[46]。

2.1.2适宜的培养环境

温度是对食用菌生长发育影响最活跃、最重要的因素之一，尤其是高温，对菌丝的生长速度、细胞结构、抗感染能力及酶活性有明显影响。不同种类食用菌、同一种类不同品种在菌丝生长阶段所需的温度有所不同，在实际生产中，应根据所生产食用菌的生物学特性将菌丝培养温度控制在适宜范围内。综合前人对菌丝培养温度的研究结果[47-50]，可以将食用菌菌丝生长温度分为3种温型，分别是：Ⅰ类，菌丝生长最适温度范围30～37 ℃，代表类型仅有草菇；Ⅱ类，菌丝生长最适温度范围25～30 ℃，代表类型有侧耳属多数菌类、黑木耳、毛木耳、茶树菇、姬松茸、虎奶菇、鲍鱼菇、灵芝、竹荪、灰树花等等；Ⅲ类，菌丝生长最适温度范围20～25 ℃，代表类型有金针菇、双孢蘑菇、金耳、猴头菇、白灵菇等等。

食用菌菌丝生长阶段对水分和通风有其特定要求，培养料含水量宜控制在60%～65%，若含水量过高且通风不足，则会导致缺氧，呼吸作用减弱，菌丝生长发育缓慢或者异常。空气相对湿度不宜过高(不超过70%)，否则容易引起培养环境滋生各种霉菌，进而感染菌种，导致菌种不纯[51]。

此外，菌种培养阶段应尽量避免太阳光直射，虽有研究表明，凤尾菇、灵芝、香菇等菌类的菌丝在白光或者较弱的散射光下能较好地生长[20-22,52]，但多数菌类的菌丝在黑暗条件下生长更好，强光抑制菌丝体生长，最好遮光培养。

2.2 适宜的菌种保藏方法

适宜的保藏方法对保持食用菌菌种活力及保存菌种优良性状都有极其重要的作用。原种及栽培种都是成批量生产，数量多、体积大，很难放于冰箱保存。菌龄是影响菌种的活力重要因素，菌龄过大，菌丝易老化，严重时会产生自溶现象[19]。一般生产出来要紧接着使用，原则上不超过1个月，只能作短期保藏。

为了较长时间保持菌种在遗传、形态和生理、种性上的稳定性，常采用控制温度、营养、氧气、水分等因素的方法，抑制食用菌母种的菌丝新陈代谢活动，从而最大限度地保存菌种的性状并延长保藏时间。生产中母种常用的保藏方法有斜面低温保藏法、-80 ℃低温保藏法、液氮超低温保藏法、液体石蜡保藏法、蒸馏水保藏法、冷冻真空干燥法等等[53-54]。综合保藏后菌种酶活性及萌发生长情况，在实际生产中，斜面低温保藏法适合各菌类的短长期(3～12个月)保藏，成本相对较低，但需要定期更换培养基转管后再冷藏，操作繁琐[55-57]；液氮超低温保藏法适合大部分菌类的长期(1～10年)保藏，流程简便，但成本相对较高[58-60]。除上述保藏方法外，也有学者利用自然基质(如木屑)结合冰箱冷藏的方式保藏食用菌菌种，对金针菇、黑木耳、香菇、猴头菇、灵芝、茯苓等菌类的菌种保藏效果非常显著，具有保藏时间长(1～8年)、方法简便、原料易取、不需要特殊设备的优点[61,62]。

2.3 控制菌种传代次数

在食用菌菌种生产中，需要对菌种进行母种、原种及栽培种进行逐级扩繁，而菌种传代次数越多，产生突变的几率越高，菌种发生衰退的机会就越多。在生产中应严格控制菌种传代次数，尤其是母种，一般不能超过5代。在菌种传代保藏中，除需控制传代次数外，应适时变换培养基质或改变配方进行提纯复壮，增强其活力[63]。

2.4 其他方法

采用臭氧、紫外线灯、甲醛熏蒸可对接种室进行彻底的杀毒灭菌[64]。提高菌种生产者的素质，要熟悉无菌操作技术，对其保藏和使用品种的种性有全面的了解，有丰富的菌种鉴定、鉴别经验，以避免在菌种生产中出现人为选择的错误。还可定期分离菌种进行复壮，即选取具典型亲本特征或优于亲本性状的子实体进行菌种分离，并选择菌丝粗壮、活力强、纯度高的优良菌株进行菌种生产，这些措施有利于从源头上防止杂菌感染和菌种衰退[65]。

3 存在问题与展望

菌种质量是由自身的遗传特性、外界的生长条件、人为因素共同决定的，只有综合考虑以上几个因素才能从本质上对菌种质量进行有效地控制。关于影响食用菌菌种质量的环境因素[21-30]及相应的解决措施有诸多报道[53-65]，但对食用菌内部遗传物质(基因)如何调控菌丝体生长发育，霉菌如何侵染菌丝体，菌种老化、种性退化的形成机制等研究还不够深入，后续的研究应该进一步去探明这些具体问题的形成机理。

在食用菌生产中，菌种质量的优劣直接影响着食用菌的产量和品质，是产生经济效益的关键因素之一，在实际生长中，存在大规模多批次的用种需求，需要对菌种进行频繁的继代培养。因此，杂菌感染、老化及品种种性退化等突出问题往往是无法完全避免的，通过了解和掌握影响食用菌菌种质量的因素及提高菌种质量的处理方法，提前对使用品种的种性有全面而丰富的鉴定、鉴别经验。通过加强营养、培养条件控制，结合适宜的菌种保藏手段，并提高菌种生产者的理论知识及无菌操作技术水平等方式，最大限度地减少和消除菌种培养过程中的杂菌感染及品种退化，将有利于提高食用菌的菌种制备的稳定性和均一性，对促进食用菌栽培的健康稳定发展具有重要意义。