红枣黑斑病链格孢属真菌的生物学特性

范盈盈，王富兰，王 帅，陈 贺，刘峰娟，胡东强，武爱波，王 成

(1.新疆农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所，乌鲁木齐 830091； 2.农业农村部农产品质量安全风险评估实验室(乌鲁木齐)/新疆农产品质量安全重点实验室，乌鲁木齐 830091； 3.中国科学院 营养代谢与食品安全重点实验室，中国科学院 上海营养与健康研究所，中国科学院 上海生命科学研究院，中国科学院大学，上海 200031；4.新疆农业科学院 科研管理处，乌鲁木齐 830091)

红枣是新疆林果业经济发展的重要支柱产业之一，也是新疆最具资源优势和发展潜力的食品产业。自2010年以来，黑斑病已成为危害新疆红枣最大的病害，造成年平均产量损失超过30%，严重时超过60%。某些年份因出现暴雨、冰雹等极端天气，引发黑斑病爆发，大片枣园基本绝收。

大量植物病理学研究[1-2]已证明引起红枣黑斑病的主要病原菌为链格孢属真菌，如链格孢菌(Alternariaalternata)、细极链格孢菌(Alternariatenuissima)等。链格孢属真菌具有寄生、腐生特点，可在田间、运输和储藏过程中侵染植物引起霉变，甚至在低温环境下也能侵染、生长，它是导致水果、蔬菜等部分冰箱储存食品腐败变质的主要微生物[3-4]。链格孢属真菌可产生70多种链格孢毒素[5-6]，包括链格孢酚(alternariol,AOH)、链格孢酚甲基醚(alternariol monomethyl ether,AME)、交链孢霉烯(altenuene,ALT)、腾毒素(tentoxin,TEN)、细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid,TeA)等。该类毒素具有致畸、致突变作用[7-10]，人类食管癌高发病率可能与之密切相关[11]。笔者课题组采用自建的QuEChERS-UPLC-MS/MS方法[12]分析了14种红枣样品中的链格孢毒素，发现TeA、AOH、AME和TEN 在所有黑斑病红枣中都有检出，其中TeA的检出率最高。

目前，仅有中国学者对红枣黑斑病有研究，且多集中在黑斑病的危害分布[13-14]、病原菌鉴定[15-16]、发生规律[17-18]以及防控[19-20]等方面，对病原菌的生理学特性、尤其是产毒特性鲜见系统研究。本试验利用‘骏枣’黑斑病果实中分离、纯化得到的10株链格孢属真菌，进行其生理学特性方面的研究，测定所产毒素的种类及含量，以期找到优势产毒菌，用于后续其产毒条件和影响因素研究，为红枣黑斑病的防治及链格孢毒素的防控奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株 根据前期病原菌的分离鉴定结果，选取5株链格孢菌(A.alternata，编号为：JZAa01～JZAa05)和5株细极链格孢菌(A.tenuissima，编号为：JZAt01～ JZAt05)用于生物学特性研究。

1.1.2 试验材料 PDA固体培养基：马铃薯浸粉3.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂14.0 g，加水补足 1 000 mL；察氏(Czapek)固体培养基：KCl 0.5 g，蔗糖30.0 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，K2HPO41.0 g，NaNO33.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，琼脂 15.0 g，加水补足1 000 mL；红枣固体培养基：红枣粉200 g，琼脂15.0 g，加水补足1 000 mL。

链格孢酚(AOH)、链格孢酚甲基醚(AME)、细交链孢菌酮酸(TeA)、腾毒素(TEN)、交链孢霉烯(ALT)、链格孢毒素(ATX-I)等20种常见真菌毒素标准品(奥地利Romer公司)；乙腈、甲酸(LC-MS级)(美国Fisher公司)；亮氨酸脑啡肽、IMS校准液(美国Waters公司)；屈臣氏纯净水。

1.1.3 仪器设备 超高效液相色谱-高分辨质谱(Vion IMS QTof MS)(美国Waters公司)、Nikon ECLIPSE E200显微镜(日本尼康仪器有限公司)。

1.1.4 毒素检测条件 色谱条件：色谱柱ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100 mm,1.8 μm)；柱温40 ℃；流动相体系为含φ=0.1%甲酸的水(A)和含φ=0.1%甲酸的乙腈(B)，梯度洗脱程序0～2.5 min，5%的A升到80%，2.5～ 4.5 min，80%的A升到90%，4.5～6 min，90%的A保持不动，6～7 min，90%的含A降到5%；进样量为5 μL；流速为0.3 mL/min。

高分辨质谱条件：全离子扫描模式，毛细管电压为3.0 kV；去溶剂化温度为350 ℃,源温度为125 ℃,去溶剂化气流为800 L/h,锥孔气流为50 L/h,碰撞气体为氩气，压力为4×10-3mbar。通过自建数据库进行定性分析。

自建数据库含有常见的20种真菌毒素：黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、AOH、AME、TEN、ALT、TeA、ATX-I、呕吐毒素(DON)、恩镰孢毒素A(Enn A)、恩镰孢毒素B(Enn B)、伏马毒素B1(FB1)、棒曲霉毒素(PAT)、HT-2毒素、T-2毒素、白僵菌素(BEA)、玉米赤酶烯酮(ZEN)、赭曲霉毒素A(OTA)。

1.2 方 法

1.2.1 菌株生长速率 将10株供试菌株在PDA培养基上活化后，用5 mm打孔器取边缘菌苔分别接种于PDA培养基、察氏培养基和红枣培养基上(直径均为9 cm)，置于25 ℃恒温培养箱中培养3、4、5、6、7、10 d后，用十字交叉法测量菌落直径，重复3次。

1.2.2 产孢量 将10株供试菌株在PDA培养基上活化后，用5 mm打孔器取边缘菌苔分别接种于PDA培养基和红枣培养基上，培养7 d，无菌水洗下孢子，用血球计数板测产孢量，重复3次。

1.2.3 孢子萌发率 制备浓度为104个/mL各供试菌株孢子悬浮液，分别取50 μL涂布于察氏培养基上，25 ℃黑暗放置6 h，在40倍显微镜下计数视野中萌发和未萌发的孢子数，其中以芽管长度>孢子半径或1/2长轴长度的孢子计为萌发孢子，计算孢子萌发率，每视野观察的孢子数>300个，每处理重复3次，试验结果以百分数表示。

1.2.4 菌苔致病力 将活化后的各供试菌株转接于PDA培养基中，25 ℃黑暗培养3 d，用灭菌打孔器取菌落边缘直径5 mm的菌苔，针刺法接种到已用φ=75%酒精消毒过的健康脆熟期骏枣上，25 ℃保湿培养3 d后，测量病斑的直径，比较各菌株菌苔的致病力差异。

1.2.5 毒素产生种类及含量 将活化后的10株供试菌株，分别接种到红枣培养基和PDA培养基上，培养7 d后，用打孔器分别取5 mm菌饼置于离心管中，向其中加入1 mL乙酸乙酯(含φ=1%甲酸)，震荡1 h，4 000 r/min离心5 min。将上清液转入一个新离心管中，放于通风橱内待溶剂挥干，向离心管中加入500 μL甲醇再次溶解，过0.22 μm有机滤膜，滤液经超高效液相色谱-高分辨质谱仪进行毒素筛查分析。

1.3 数据处理

用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析，用Duncan’s 进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 培养基的种类比较

分别将10株供试菌株接种到察氏培养基、PDA培养基和红枣培养基上培养，结果(图1和图2)发现10株菌株在红枣培养基上生长速度略高于PDA培养基，PDA培养基高于察氏培养基，在第3天时，10株供试菌株在红枣培养基和PDA培养基上生长的平均直径差别不大，随后在红枣培养基上的平均生长速度开始加快，直到第7天后，开始逐渐长满整个培养基；而10株供试菌株在PDA培养基和察氏培养基上的平均生长速度均较低，且速率基本保持一致。这3种培养基的区别在于碳源和氮源，PDA培养基的碳源和氮源分别为马铃薯中的淀粉、葡萄糖和蛋白质、氨基酸，察氏培养基的碳源和氮源分别为蔗糖和NaNO3，红枣培养基的碳源和氮源分别为红枣中的多糖和蛋白质、氨基酸。由此可知，链格孢属真菌更倾向于生长在含有机营养物的培养基上。

A.JZAa05/察氏培养基；B.JZAa05/红枣培养基；C.JZAa05/PDA培养基；D.JZAt03/察氏培养基；E.JZAt03/红枣培养基；F.JZAt03/PDA培养基

图2 10株供试菌株在不同培养基上培养不同时间后的平均直径Fig.2 Average diameters of 10 test strains cultured on different mediums of different days

2.2 不同菌株的平均生长速率比较

分别将10株供试菌株接种到红枣培养基上，于第3、4、5、6、7、10天后测量菌落直径，计算3～10 d内的平均生长速率(图3)，发现JZAa01～JZAa05菌株的平均生长速率都保持在0.6 cm/d以上，而且几乎不存在显著性差异，而JZAt01～JZAt05菌株的平均生长速率均低于0.5 cm/d，说明A.alternata比A.tenuissima更适于在红枣培养基上生长。

2.3 不同菌株产孢量比较

分别将10株供试菌株接种到红枣培养基上(图4)，25 ℃下培养7 d后，用血球计数板测产孢量，发现JZAa05菌株的产孢量最高，达到1.8×107个/mL，JZAt01菌株的产孢量最低，为1.0×107个/mL；而且从图4可以看出，JZAa01～JZAa05菌株的平均产孢量普遍略高于JZAt01～JZAt05菌株，这与不同菌株在红枣培养基上的平均生长速度的结果相一致，进一步验证了A.alternata比A.tenuissima更适于在红枣培养基上生长。

2.4 不同菌株孢子萌发率比较

将相同浓度的各菌株的孢子悬浮液涂布于察氏培养基上，6 h后观察孢子萌发情况，通过比较不同菌株孢子的萌发率发现(图5)，JZAa05、JZAt03和JZAt04菌株的平均孢子萌发率均超过80%，其中JZAt03的最高。说明这3株菌株的生存活力较强。

图柱上不同字母代表具有显著性差异(P<0.05)。下同

图4 不同菌株在红枣培养基上培养7 d后的平均产孢量Fig.4 Aaverage amounts of spores production of different strains cultured in red jujube medium after 7 days

图5 不同菌株的平均孢子萌发率Fig.5 Average spore germination rates of different strains

2.5 不同菌株的菌苔致病力比较

将相同大小的各菌株菌苔分别用针刺法接种到健康的脆熟期骏枣上，常温常湿下隔离放置3 d后，发现10株菌株均能使健康青枣染病，其中JZAa05菌株在‘骏枣’上的致病直径达到5 cm，且接种面均变黑、腐烂，JZAa01菌株能使骏枣表面有小面积病斑(图6)。通过比较病斑直径发现，JZAa05菌株的致病力最强，JZAa01 和JZAa03菌株的致病力最弱。

2.6 不同菌株的产毒种类及含量比较

将10株供试菌株分别接种到红枣培养基和PDA培养基上培养7 d后，溶剂法提取菌饼，用超高效液相色谱-高分辨质谱检测产生的毒素种类，发现(图7～8、表1～2)不同菌株在2种培养基上除了产生大量的链格孢毒素外，还产生少量的恩镰孢毒素和HT-2毒素。2种培养基所产生种类最多的均为TeA，分别达到82.30 μg/kg(红枣培养基)和128.90 μg/kg(PDA培养基)。同时PDA培养基上也产生了较多的AOH(0.06～ 24.96 μg/kg)、AME(0.16～36.55 μg/kg)和ALT(0～41.90 μg/kg)，其含量普遍高于红枣培养基上同种毒素的含量。从菌株种类来看，A.alternata比A.tenuissima更适于在红枣培养基上产生更多的毒素。在红枣培养基上的优势产毒菌为JZAa02，JZAa03次之；而在PDA培养基上的优势产毒菌为JZAa03，JZAa02次之。

图6 不同菌株对健康骏枣的致病力Fig.6 Average diameters of black spot resulted from different strains inoculated onto health Jun jujubes

图7 不同菌株在红枣培养基上培养7 d后的产毒种类和含量Fig.7 Types and contents of toxins produced by different strains cultured on red jujube medium after 7 days

3 结论与讨论

链格孢属真菌种类繁多，适应能力强，大多数寄生在植物上，可引起多种蔬菜、水果、粮食等作物病害。目前，众多学者针对从不同植物寄主，如红枣[16]、玉米[21]、番茄[22]、树莓[23]等病害样品上分离得到的链格孢属真菌都做了生物学特性研究，涉及到的特性参数主要有培养基种类、培养温度、pH、光照、碳源、氮源等，这些前人研究得到的最优参数范围针对不同种类的链格孢属真菌没有太大区别，故在本研究中，直接设定培养温度为25 ℃，碳源、氮源及pH以所选的培养基为准，未做额外的调整。本研究在相同的培养条件下，主要探究不同种类的链格孢属真菌(A.alternata和A.tenuissima)在不同培养基上的生长速率、产孢量、产毒种类及含量等方面的差异，研究结果发现：(1)相比较PDA培养基和察氏培养基，10株链格孢属真菌在红枣培养基上的生长速度最快，表现一定的寄主特异性，此研究结果与郑肖兰等[21]的研究类似；(2)在红枣培养基上，A.alternata比A.tenuissima的生长速度更快，说明链格孢菌是红枣黑斑病的优势病原菌，这与董宁等[15]、郭东起等[24]的研究结果一致，与宋博等[2]的研究结果不一致，可能与黑斑病枣采集时病害发展进程、病害发生区域等有关；(3)A.alternata和A.tenuissima在PDA培养基上比在红枣培养基上能产生更多种类、更高含量的真菌毒素，这与从病枣中直接检测到的毒素种类和含量高低结果一致[12,25]；(4)在相同的培养基上，A.alternata比A.tenuissima产生的毒素含量更高，尤以JZAa02和JZAa03最甚，更进一步说明了A.alternata为优势菌株。

表1 不同菌株在红枣培养基上培养7 d后的产毒含量Table 1 Contents of toxins produced by different strains cultured on red jujube medium after 7 days μg/kg

图8 不同菌株在PDA培养基上培养7 d后的产毒种类和含量Fig.8 Types and contents of toxins-production of different strains cultured on PDA medium after 7 days

表2 不同菌株在PDA培养基上培养7 d后的产毒含量Table 2 Contents of toxins produced by different strains cultured on PDA medium after 7 days μg/kg

综上所述，链格孢属真菌是引起红枣黑斑病的主要致病菌，其种类较多，但是大部分的优势产毒菌为A.alternata，该菌的生存活力强，在不同的培养基上生长速度有差异，且产生的毒素种类和含量也不尽相同。综合考虑产孢量、孢子萌发率和致病力，JZAa05为优势菌株。通过本试验选出的优势产毒菌株，将用于后期系统探究其产毒条件及影响因素，进而得出新疆红枣中链格孢毒素的产生规律。