人参黑斑病防治及抗病育种研究进展

张宁，张晶晶，侯微，李亚丽，曲正义，郑培和

（中国农业科学院特产研究所，吉林省中药材种植（养殖）重点实验室，吉林 长春 130112）

人参（Panax ginseng）为五加科人参属多年生草本植物，是我国的名贵中药材，主要分布在吉林、辽宁和黑龙江3省。人参在生长期间易受多种病害侵袭，黑斑病是人参严重的病害之一。黑斑病是由链格孢真菌引起的典型流行病和循环性病害，主要侵害人参叶片，其次是茎、花和果实，致使人参质量和产量降低，因此对于黑斑病应积极防治。本文综合阐述了近年来研究人员在人参黑斑病的危害、发病情况和防治措施方面的研究，结合大田植物抗病育种研究进行分析，对今后通过分子育种等手段更有效地防治黑斑病进行了展望，期望为科学防治人参黑斑病及抗黑斑病育种提供参考。

1 人参黑斑病的发病特征及危害

1.1 人参黑斑病的发病特征

黑斑病是药用植物的常见病害。人参黑斑病是由半知菌亚门丝孢纲链格孢属（Alternaria Nees）真菌引起[1]，主要致病菌为人参链格孢（Alternaria panax Whetz）[2]和链格孢（Alternaria alternata）[3,4]。人参黑斑病发病于人参地上部分，主要表现为受侵害处产生不规则水渍状的褐色或灰褐色病斑，导致植株受害部位折垂至枯萎死亡[5]。人参黑斑病最先发于叶片，产生不规则水浸状黄褐色病斑，后逐渐变成褐色，遇阴雨潮湿天气迅速扩展，使得病斑外缘处呈轮纹状，干燥后极易破裂，病斑逐步扩大汇合使整个叶片枯死[6]。叶柄及花梗被害时，病斑椭圆形，上下扩展呈长条形，褐色，多凹陷，环切使茎秆折倒，叶柄下垂，花序枯死。随着病害的加重逐步蔓延至花和果实，被害果实表面初期呈水浸状不规则形的褐色斑点，外果皮逐渐干瘪，内部种子呈灰黑色皱缩，表面密生黑色霉层，形成“吊干籽”。根、根茎及芽苞受害，产生圆形棕褐色腐烂斑，逐渐扩展及全根，并变黑腐烂。

研究调查发现人参黑斑病菌以菌丝体和孢子在植株病残体和土壤中越冬，并随着雨水飞溅和空气流动进行传播附着到植株上，当达到一定的温度和湿度时孢子萌发菌丝蔓延，通过气孔或伤口侵入人参叶片，长出侵染菌丝伸入附近细胞内，从叶片组织中吸取养料和水分快速繁殖。人参黑斑病多于5月中下旬开始发病，6月份病情发展趋于平缓，7月份温度升高，降雨量增大，当空气相对湿度达90%以上时病情急剧发展，8月份出现发病高峰，9月上旬达到顶点。

1.2 人参黑斑病的危害

黑斑病作为人参病害之一，严重影响我国人参产业的发展。从1904年VanHook发现该病害后，黑斑病一直持续地对人参的生长生产造成影响。人参黑斑病在叶片上发病，直接导致叶片光合作用速率下降，影响植株能量积累，严重时影响药用植物产种及参根芽孢的产生，易造成人参早期落叶、植株提前枯萎、不能结实及参根减产30%~80%[7,8]，导致人参质量和产量降低。发病率调查显示，人参黑斑病常年发病率为20%~30%，严重时达70%[9]。

2 人参黑斑病防治措施

2.1 科学管理对人参黑斑病的防治

黑斑病菌的孢子和菌丝体存在越冬的特点，在管理参田时要及时清除病原。在秋季清理床面，春季种植时对种子或参苗做好消毒处理工作；采用日光消毒或干柴草烧烤消毒的方式处理参床，杀死土壤表层的病菌芽孢、菌丝及其他害虫[10]。加强田间管理，在植株生长期间及时拔除田间病株，防止病原孢子大面积传播。直射光下生长的人参黑斑病发生较重，而全阴棚下生长的人参黑斑病发生较少，因此要及时做好遮阴工作并使参棚透光均匀一致，防止漏雨，参床做好排水，防止积水引发各种疾病。

2.2 化学制剂对人参黑斑病的防治

为保障人参的产量，降低黑斑病的发生率，目前已开发了一系列防治方法，化学防治以使用化学制剂为主。先正达集团研制的11.7%丙环唑+7%偶氮菌酯混悬剂对人参链格孢霉黑斑病有较好的防治效果[11]。关昕等[12]对各药剂田间药效试验表明，化学药剂异菌脲对人参黑斑病的防效最好且毒性低，可抑制真菌孢子的萌发及产生，也可抑制菌丝生长。郑芝强等[13]实验表明，50%美派安可湿性粉剂防治人参黑斑病有较好的效果，800倍液的50%美派安可湿性粉剂防效可达到84.38%。李勇等[14]实验表明，低毒化学杀菌剂新益甲托、金万霉灵和多菌灵对人参黑斑菌的抑制力较好，可考虑对人参黑斑病进行田间防治。葛尧伦等[15]合成了一种有效成分为四霉素与中生菌素的杀菌组合物，可用来防治人参和三七的黑斑病。Tang和王雪等[16,17]研究认为，10%苯醚甲环唑WG、72%农用硫酸链霉素SP、50%克菌丹WG、25%丙环唑EC和50%嘧菌环胺WG等化学制剂对人参黑斑病都具有较为良好的室内抑菌作用。

2.3 生物制剂对人参黑斑病的防治

人参黑斑病生物防治以微生物菌剂为主。卢丽珍等[18]研究表示，人参黑斑病以基施地养力微生物菌剂3.6 kg/10 m2，5月、7月、8月各喷施1次高保康3号微生物菌剂2.3 L/10m2处理参地，发病率最低，防治效果最好。近年来为了更安全更有效地防治黑斑病，诸多学者从病原菌生长着手，通过植物提取液和微生物发酵液抑制人参黑斑菌的生长。丁香、藿香和苦参3种中药提取物在质量浓度为1.0 kg/L时，对人参黑斑病菌菌丝生长的抑菌率达100%、92.2%和89.2%，抑菌效果均高于常用化学农药代森锰锌[19]。赵玉婷等[20]表示从藜芦中分离提取的白藜芦醇对人参黑斑菌有很好的抑制作用。Ji等[21]从种植人参的土壤中分离出对人参黑斑病有良好抑制作用的菌株CNU114001。研究还发现诸多人参黑斑病病原菌的生防菌株资源，如吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）[22]、球毛壳菌（Chaetomium globosum）[23]、土壤短波单胞菌（Brevundimonas terrae）[24]和芽孢杆菌（Bacillus）[25,26]等对人参黑斑病菌都具有较好的拮抗作用。管成林[27]采用平板对峙法筛选到一株铁皮石斛同源内生拮抗菌（Burkholderia sp.），对黑斑病病原菌（C.oxysporum和A.alternata）有较强的拮抗效果。

化学防治具有快速高效、效果稳定等优点，但在防治过程中化学农药的不科学使用，容易引发中药材农药残留超标、环境污染和土壤微生物失衡等系列问题。而且过度使用化学药剂还可能导致病原菌产生耐药性[28]。研究发现三七黑斑病菌已出现对烯唑醇产生抗药性的趋势[29]。微生物制剂具有安全、环保等优点，但也存在菌株退化、防效不稳定和防治力度弱等缺点。因此，亟需寻求新的方法，更安全有效地治理黑斑病。

3 抗病育种对黑斑病的防治

育种（Breeding）是通过创造遗传变异、改良遗传特性以培育优良动植物新品种的技术。植物育种方式主要包括杂交育种、诱变育种、单（多）倍体育种、分子育种和离体培养技术，抗病选育出的品种具有绿色环保、遗传稳定及效果优异的特点。优良品种培育是进一步发展药用植物栽培的重要前提。培育新型抗病品种是解决黑斑病的根本办法。

3.1 常规育种对黑斑病的防治

常规育种（traditional breeding）是育种工作中常用的传统育种技术方法。主要包括选择育种、杂交育种、诱变育种、离体组织培养育种和多倍体育种等。

药用植物生长周期普遍较长，育种基础薄弱，驯化程度低、栽培条件苛刻[30]，其稳定的品系种质资源少，野生资源杂合度高，开展抗病育种工作尤为困难。杨涛等[31]对三七抗病植株筛选方法进行了优化，表示离体叶片接种法有望在药用植物中用于筛选抗病植株，可用于开展今后的育种工作。中国医学科学院药用植物研究所、集安市人参研究所和康美新开河（吉林）药业有限公司等单位从1981年开始历经32年选育出中抗黑斑病且高产的‘新开河1号’[32]。益盛药业与吉林农业大学于2013年联合选育的‘益盛汉参1号’，抗病能力强，适于在吉林省白山、通化地区推广种植。Kim等[33]采用纯种选育方法鉴定了一个抗逆性增强的人参品种‘Kowon’，并通过8年的培育和5年的试验确定该品种具有较强的抗黑斑病能力和高产能力。韩国于2013年选育出品种‘Cheonryang’[34]，抗逆性强，对链格孢引起的人参黑斑病具有一定的抵抗能力。

相对于药用植物，大田作物生长周期短，常规育种工作开展较为顺利。石庆娜等[35]以2个自交不亲和系DS96-7和DS99-13为亲本配置成秋大白菜杂交种‘秦白80’，抗黑斑病且产量高。科研人员经对番木瓜[36]研究发现优良品种SS72/12自交和杂交均可获得对黑斑病抗性较强的品种。欧承刚等[37]采用加性显性遗传模型，研究发病时期黑斑病抗性的动态遗传规律，获得了可以显著增加后代黑斑病抗性的亲本材料。大田植物抗病植株筛选及抗病育种研究工作的进行，为药用植物抗黑斑病育种工作提供了参考与借鉴作用，为药用植物抗病育种工作的开展打下了良好的基础。

3.2 现代分子育种对黑斑病的防治

常规育种在育种工作中占有重要地位，培育出了许多性状稳定且纯度高的优良品种，但常规育种的育种周期长，在抗病性状方面过度依赖于自然环境选择，仅利用常规育种手段很难在抗病育种上取得突破。随着分子遗传学和分子生物学的不断发展，现代分子育种技术在动植物育种领域得到大量应用，人们逐渐将目光渗透到植物体内，研究其抗病的本质，筛选植物抗黑斑病的基因。

在人参抗病育种的研究中，尹锐[38]开展人参黑斑菌诱导人参抗病的机制及其分子检测方面的研究，通过转录组测序对人参黑斑菌侵染人参叶片Pg NBS基因表达模式进行分析，获得了系列差异基因，发现一些对人参黑斑菌胁迫产生应答的Pg NBS基因，这些基因可作为抗黑斑病的候选基因，为人参抗黑斑病育种和人参黑斑病的防治提供科学依据。Wang等[39]利用病程相关蛋白（PR）的5个编码基因对人参品种K-1扩增，进行多态性挖掘，结果在品种K-1的PR5基因中发现了一种能将天冬氨酸残基转化为天冬酰胺的编码SNP，氨基酸残基的修饰改变了PR5蛋白的二级和三级结构。该SNP标记能有效的特异性鉴别K-1和其他品种。生物信息学分析表明，该突变位点对PR5蛋白结构的改变，可能会影响其抗病性。张蕾等[40]克隆了一个在林下参中高表达的基因g38，可用于提高人参的抗病性能。

三七作为人参属五加科另一药用植物，与人参具有较近的亲缘关系，其黑斑病相关研究对人参黑斑病抗病育种具有重要意义。许振宁[41]对感染黑斑病不同时间点的三七叶片进行转录组测序，结合分子标记技术和生物信息学技术进行分析，发现PnCHI1基因参与三七对黑斑病菌的防卫反应。陈瑞等[42]分析三七多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因（Pn PGIP）基因表达特性，发现该基因在接种人参链格孢后显著上调表达，并受几种逆境胁迫相关信号分子的诱导，推测该基因可能参与了人参链格孢的防卫反应。Li等[43]将重组PnTLP2蛋白在大肠杆菌中表达并进行黑斑病菌抑菌检测发现其具有较强的抑菌活性，将PnTLP2在转基因烟草中过表达增强了对人参链格孢的抗性，表明PnTLP基因是三七对三七黑斑病菌感染的防御相关基因。

相对于药用植物，大田作物在分子育种方面的研究更加透彻，各种分子方法的运用为人参抗黑斑病基因的挖掘提供借鉴。Liu等[44]通过对菊花及其黑斑病病原菌进行双物种动态转录组测序揭示了菊花与黑斑病菌的相互作用机制。Shingo等[45]对207个梨品种进行了全面地接种测试和基因分型，确定了一个适用于黑斑抗性选择的标记集，并通过使用连锁分析确定了中国梨黑斑病易感基因的位置。方婷[46]运用qRT-PCR对苜蓿叶片中的基因进行检测，推测MnSOD、Cu-ZnSOD、NPR1及NPR1L等基因参与了紫花苜蓿对链格孢菌的早期抗性反应。张真建[47]表示在不同的组织部位中木香花RbRdr1的表达量差异显著，且在受黑斑病菌侵染后的不同时期，该基因的相对表达量均积极上调，表明该候选基因可能参与了黑斑病菌的互作过程。许高娟[48]通过转基因技术将hrfA基因转入到菊花中，检测发现基因hrfA能够稳定地遗传并在转录水平上成功表达，获得的17株具Km抗性的hrfA基因转化株对黑斑病的抗性明显提高。Yang等[49]通过自然感染和人工接种两种方法评估了不同梨叶枯病菌基因型对黑斑病的抗性，结合SSR分子标记筛选出6167B和15091C两个抗病品种。王惠哲等[50]以黄瓜感染黑斑病分离群体为试材，将与黑斑病抗性相关基因连锁的一个共显性AFLP标记E-CC/M-CAT进行了测序，发现了一个可以作为黄瓜抗黑斑病辅助选择的标记。

4 结语与展望

黑斑病作为药用植物的一大病害，严重制约着人参产业的健康发展。人参黑斑病目前已明确致病菌和田间发病情况，总结出系列降低黑斑病发病率的科学管理方法，发掘出诸多化学试剂、各类提取物及微生物菌剂用于黑斑病防治；人参黑斑病分子方面的研究也在转基因和生物信息学手段的辅助下推测出了一些抗病相关的基因。但是人参黑斑病致病机制和人参抗黑斑病机制等问题尚未研究透彻，发掘出的候选基因的抗病性及抗病机理尚未明确，完全抗黑斑病的人参品种也还未被选育出来，人参黑斑病抗病育种工作任重而道远。为了更好地解决人参黑斑病问题，本研究认为首先要探明人参黑斑病的致病原因和机理，从细胞层面研究黑斑菌毒素的作用；挖掘人参抗黑斑病的种质资源，对人参抗感黑斑病的株系加以开发和利用，挖掘植株自身抗病基因并对抗病候选基因进行验证，结合转基因技术明确基因功能，确定基因抗病机理；加强抗病基因连锁性分析，结合分子标记技术辅助育种，培育抗黑斑病品种，更好的防止人参黑斑病的发生，推进人参产业发展。