月季黑斑病病原菌鉴定及生物学特性研究

陈雪莉

（青岛市市级公园管理服务中心青岛市海泊河公园，山东 青岛 266000）

从已掌握的月季病虫害种类的危害性角度来看，黑斑病对月季健康情况影响最严重，并且发病率很高，在我国多地月季种植区域均有出现[1-2]。2021年在青岛市海泊河公园的月季绿化带中发现多株月季患有黑斑病。为此，文章以该地区的患病月季植株为试验对象，以分离纯化的方式从形态与分子方面对黑斑病病原菌种类与生物学特性进行鉴定分析，以期为相关防控单位或科研人员提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

患病植株选取。以青岛市海泊河公园月季绿化带下患黑斑病月季植株（整株）为研究材料，在试验内截取患病叶片作为分离与对照材料。

试剂和培养基。测定试剂采用赛默飞公司的DL DNA Marker、博奥龙2×Taq PCR Mixture（含上样染料）、Loading buffer，引物见表1 所示。

表1 试验合成引物序列

试验使用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，配制方法如下。选取干净且水煮后的马铃薯200 g（滤液）、葡萄糖与琼脂各20 g，将琼脂与马铃薯滤液充分搅拌，待琼脂完全容积后向其中加入称取好的葡萄糖，将冷却后的蒸馏水（1 L）加入其中并将培养液的pH 值调节为7.0，最后将培育液包好放于灭菌锅中灭菌，灭菌完成后取出冷却备用。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离

月季叶片与黑斑病菌丝采用单孢分离法分离。首先，挑选整株月季患病植株中具有明显黑斑病的患病叶片送至实验室，在黑斑病斑点与叶片的交界处选取9 mm×9 mm 的组织块，将其浸泡在浓度为75%的乙醇溶液中消毒，浸泡30 s 后取出，用无菌水漂洗，共漂洗3 次。其次，将其浸泡在浓度为2%的次氯酸钠溶液中，浸泡时间为60 s，浸泡完成后再次用无菌水浸洗，共浸洗3 次。再次，将其放置在灭菌滤纸上转移至无菌室晾干，晾干后将其移放至环境温度为28 ℃恒温环境下的PDA 培养基上进行培养。采用第三次清洗液制作涂布平板并将其作为阴性对照，培养4～5 d 后观察黑斑病菌菌落生长状况，取菌丝尖端孢子放置于新的PDA 培养基中进行培养（培养环境为28 ℃），不断重复上述操作直到分离出纯化菌株。

1.2.2 黑斑病病原菌的形态学鉴定

初步观察纯化菌株培养基下的菌落疏密程度和颜色等菌落特征，将其放置在光学显微镜下进行镜检，重点观察对黑斑病病原菌菌丝和分生孢子的特征，例如分生孢子的形状、大小、残缺程度、孢子梗以及孢子有无隔膜等信息。

1.2.3 黑斑病病原菌的分子生物学鉴定

使用CTAB 法对月季黑斑病病原菌的DNA 进行提取，实际操作步骤如下。首先，需要在试验开始前将2-丙醇（C3H8O）放置在-20 ℃环境下预冷，将浓度为70%的乙醇放置在4 ℃环境下进行恒温处理，将试验使用的水浴锅加热至57 ℃。用无菌枪头刮取0.1 mL的纯化黑斑病菌丝，并将其置于2 mL 的离心管中，将石英砂（20μL）和2%的CTAB 提取缓冲液（300 μL）加入装有黑斑病菌丝的离心管中，使用研磨棒对其进行研磨直到所有物体研磨充分为止。向离心管中在此加入2%的CTAB 提取缓冲液（200 μL）并充分震荡，将其放置在57 ℃的水浴锅中恒温加热1 h 后使其自然冷却至室温，期间要注意每隔10 min 对离心管进行1 次颠倒混匀。其次，当水浴操作结束之后，需将等体积的500 μL 三氯甲烷（CHCl3）和C3H8O（比例为24∶1）溶液加入离心管中，将其放置在离心机中以10 000 r/min的速度离心10 min，在离心操作期间需要将浓度为10%的CTAB 提取缓冲液放置在65 ℃环境的水浴中加热。取离心后上清液（300 μL）放置在新的离心管中，并将已加热完成浓度为10%的CTAB 提取缓冲液（30 μL）加入新离心管中，振荡混匀，之后再向其中加入比例为24∶1 的CHCl3与C3H8O的混合液（330 mL）。再次，将新的离心管放置在10 000 r/min 离心机中离心10 min。取离心后溶液的上清液（250 μL）放置在新的离心管，并向其中加入预冷好的C3H8O（250 μL）轻轻混匀，将其放置在-20 ℃环境下静置30～60 min，将静置完成的溶液再次放置在参数为12 000 r/min、温度为4 ℃的离心机中离心10 min。最后，将离心完毕的溶液上清液缓慢剔除并倒置片刻，向离心管中加入提前预冷浓度为70%的乙醇洗涤（1 mL），放置在10 000 r/min的离心机中震荡离心5 min。离心完成后除去上清液取剩余液体将其放置在工作台上自然风干。制作PCR 反应体系（50 μL），其中主要成分包括3 μL 模板、1 μL上游引物、1 μL 下游引物，25 μL 博奥龙2×Taq PCR Mixture（含上样染料）以及20 μL 去离子水。

PCR 反应程序参数设定：预变性环境温度为94 ℃、时间为3 min；变性温度为94 ℃、时间为30 s；退火温度为55 ℃、时间为45 s，35 个循环；延伸温度为72 ℃、时间为10 min。将扩增产物送至某生物工程研究所进行比对测序，使用BLAST 将得到的序列与DNA序列数据库GenBank 上对其同源性进行比对，并将与月季黑斑病病原菌有关的同源序列下载到本地，以EF1-α、rDNA ITS 和GPD 序列为对象，以MEGA 进化树V7.0.26 软件为基础，借助邻位法构建系统发育树[3-5]，如图1 所示。

图1 EF1-α、rDNA ITS 和GPD 联合对比所构建的系统发育树

1.2.4 致病性测定

对月季黑斑病的病原菌致病性测定将采用离体接种法进行验证。首先，在接种前需要用无菌水冲洗健康的月季叶片，去除叶片表面的杂质，然后使用灭菌接种针对叶片进行破坏处理。其次，把放置在28 ℃环境下培养的病原菌通过打孔器制成半径为2.5 mm 的菌饼，并将其接种到健康月季叶片的接种点处，使用无菌PDA 培养基作为对照。再次，把接种后的对照叶片放在铺有湿润脱脂棉的培养皿中，维持培养环境温度处于24～25 ℃，保湿培养3～5 d，以12 d 为周期观察其发病状况。

1.2.5 病原菌生物学特性的测定

从温度、pH 值以及光照等角度对月季黑斑病病原菌菌丝生长进行试验，以平板测定法作为试验验证方法。将半径为2.5 mm 的病菌菌饼接种到PDA 培养基的中央处，设计6 组培养温度，分别为5 ℃、20 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃和50 ℃；将半径为2.5 mm 的黑斑病菌饼接种到pH 值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0的PDA 培养基中央处；将其分别置于全光照、光暗交替（交替时间为12 h）以及全黑暗等环境下，并将半径为2.5 mm 的黑斑病菌饼接种在PDA 培养基的中央处。将上述处理完毕的培养基放进培养箱中进行培养，并定期测量其菌落半径，所有处理重复3 次。

1.3 数据分析

通过IBMSPSS Statistics v 27.0.0.1 软件对试验数据进行统计与分析，运用邓肯氏多重比较法对试验数据进行差异显著性分析[6]。

2 结果分析

2.1 发病症状

月季叶片是出现黑斑病的主要部位。在黑斑病的发病初期，月季叶片正面会出现一处或多处褐色小斑点，随着时间变化，这些小斑点会逐渐扩大为近圆形的黑色斑点。在黑斑病的发病后期，月季叶片上黑斑病斑点会产生一些黑色颗粒，主要呈现零散或者轮状排列，只有少部分种类的黑斑病斑点间相互连接。同时，黑斑病后期还会导致月季叶柄上产生一些暗褐色斑点，斑点略凸起，但斑点边缘并无明显黑斑病菌丝。此时若不对其进行治疗，会造成月季叶片全部脱落或全部枯黄，严重时会间接导致月季植株死亡。

2.2 形态特征

从患有月季黑斑病的叶片病斑中获得1 株黑斑病病原菌菌株，将其命名为A1。A1 在PDA 平板上生长2 d 后能够明显看出平板上出现零星的白色菌丝，继续培养3 d 后，病原植株开始产生孢子，7 d 后黑斑病植株可以长满整个平板，此时观察黑斑病菌落表面可以发现，其菌落表面湿润但不光滑，整体呈黑褐色，孢子没有出现轮纹，如图2、图3 所示。通过光学显微镜可以看出，黑斑病病原菌的分生孢子梗呈现灰褐色且有隔膜。病菌孢子为棒状和长卵形，每个孢子均具有4～9 个横隔膜和2～5 个纵隔膜，最大分生孢子的长宽为18.5 μm×24.7 μm，最小分生孢子的长宽为3.6 μm×7.1 μm，如图4 所示，初步断定青岛市海泊河公园月季感染的是链格孢类黑斑病。

图2 培养2 d（正面）

图3 培养7 d（背面）

图4 光显微镜下病菌孢子形态

2.3 致病性鉴定

记录以致病性测定设计试验下观察黑斑病菌株的发病时间与性状。在新鲜叶片植入黑斑病菌饼后的3～5 d，其接种叶片上可以明显看出存在黑褐色病斑，且人工移植的叶片上出现的病理症状与田间月季黑斑病症状十分相似，因此可认为其发病率能够达到98%，而只在叶片中接入PDA 培养基圆片的对照组却未出现黑斑病症状，如图5～图7 所示。从接种患病叶片中分离出黑斑病病菌，将其与自然环境下的黑斑病病菌的孢子形态与菌落形态进行对比，发现二者间的孢子形态与菌落形态完全一致，因此断定青岛市海泊河公园月季黑斑病是由链格孢病原菌侵染所致。

图5 自然患病月季叶片

图6 直接PDA培养基圆片叶片

图7 人工刺伤接种黑斑病叶片

2.4 黑斑病致病菌的最适生长环境测定

图8 为月季黑斑病菌丝在不同温度、pH 值和光照条件下的生长数据。由图中数据能够得出，月季黑斑病植株的最适生长温度为30 ℃，黑斑病病原在温度20～35 ℃都可以正常生长，但不同温度环境下黑斑病菌丝的生长性状存在一定的差异。月季黑斑病植株的最适生长pH 值为6.0，pH 值为4.0～10.0 时黑斑病菌丝都能够正常生长，但菌丝的生长性状存在一定的差异。月季黑斑病植株的最适生长光照条件为全天光照，但在无光照时也可正常生长。

图8 环境因素对黑斑病菌丝生长的影响

3 结束语

经试验证实，青岛市海泊河公园下的月季植株患黑斑病孢子类型为链格孢真菌。该真菌在温度为30 ℃、pH 值为6.0 和全天光照下可以实现最佳生长。该黑斑病菌丝群初期呈现灰白色，后期逐渐变为黑褐色，分生孢子呈黑褐色棒状或卵状，具有横纵隔膜。