新型冠状病毒检测方法的研究进展

沈夏赢，李树锦，宁永凤

（合肥市第二人民医院检验科，安徽 合肥 230011）

2020 年1 月，湖北省武汉市爆发了一起严重的新型冠状病毒感染性肺炎疫情，并在短时间内迅速扩散至全国各地。据调查，截止到2020 年3 月30 日，我国累计确诊的新型冠状病毒感染性肺炎患者有八万多例，国外累计确诊的新型冠状病毒感染性肺炎患者有六十五万例，全球累计死亡的新型冠状病毒感染性肺炎患者有三万多例[1]。2019-nCoV 是诱发此次疫情的病原体。此病毒是一种线性单股正链RNA 病毒，属于冠状病毒科β 属，是一种新型的冠状病毒。2019-nCoV 的结构蛋白是M 蛋白、N 蛋白、E 蛋白、S 蛋白。2019-nCoV 有包膜，常呈圆形或椭圆形，具有多形性[2-3]，主要是通过呼吸道飞沫传播[4]，也存在通过气溶胶（空气传播）、消化道传播的可能[5]。2019-nCoV 对热能和紫外线均较为敏感。乙醚、75% 乙醇、含氯消毒剂、氯仿、过氧乙酸等脂溶剂均可以有效地灭活2019-nCoV。新型冠状病毒感染患者可出现发热、干咳、乏力的症状，少数患者伴有流鼻涕、鼻塞、咽痛等呼吸道症状，严重者可出现低氧血症、呼吸困难、休克、心律不齐等症状[6]。快速、准确地检测2019-nCoV 对疫情的控制具有重要的临床意义。本文选取临床上常用的免疫学检测法（包括胶体金免疫层析法和酶联免疫吸附法）和核酸检测法（荧光定量PCR 检测法），对这两种病毒检测方法的原理、结果判定标准、优点及局限性进行分析，以期为寻找一种快速、有效的2019-nCoV 检测方法提供参考。

1 免疫学检测法

免疫学检测法的基本原理是免疫学抗原、抗体可以特异性结合。此检测方法可分为基于免疫学抗原检测法和基于免疫学抗体检测法两种类型。抗原是导致人体免疫系统产生抗体的物质。2019-nCoV 表面的N 蛋白、E 蛋白均是抗原的表位。进行抗原检测的样本主要包括血液、痰液、咽拭子。抗体是人体免疫系统产生的用于对抗抗原的一种免疫球蛋白。发生2019-nCoV 感染后，患者机体可受到刺激而产生抗体。因此，临床上可以通过检测患者机体是否存在特异性抗体来间接诊断其是否感染了2019-nCoV。人体初次发生免疫应答时，可产生IgM 抗体。当人体再次发生免疫应答时，可产生IgG 抗体。同时检测这两种抗体可以明显提高2019-nCoV 的检出率，降低漏诊率。进行抗体检测的样本主要是血浆、血清或全血。进行抗体检测的原理与进行抗原检测的原理基本一致，在此不做赘述。免疫学检测法主要包括胶体金免疫层析法和酶联免疫吸附法。这两种检测方法的原理、结果判定标准、优点及局限性如下。

1.1 胶体金免疫层析法

1.1.1 检测原理 胶体金免疫层析法的检测原理是检测2019-nCoV 的IgG 抗体和IgM 抗体。将鼠抗人IgG 单克隆抗体和鼠抗人IgM 单克隆抗体包被在检测试剂的硝酸纤维素膜上，使之形成检测线（T 线）。将羊抗鼠IgG 抗体包被在检测试剂的硝酸纤维素膜上，使之形成质控线（C 线）。将由鼠IgG 抗体和胶体金标记的2019-nCoV 作为示踪物。在检测试剂的加样孔中加入待测样本。如果待测样本中含有2019-nCoV 的IgG 抗体或IgM 抗体，则可以与由胶体金标记的2019-nCoV 抗原相结合，生成抗原- 抗体复合物。此复合物被鼠抗人IgG 抗体或IgM 抗体（这两种抗体包被在T 线上）所捕获，使显示区出现一条紫红色条带。同时，由胶体金标记的鼠IgG 抗体在C 线区可与羊抗鼠IgG 抗体相结合，形成抗原- 抗体复合物，使显示区出现一条紫红色条带（质控线）。15 min 后，观察检测的结果。

1.1.2 检测结果的判定标准 如果IgM 抗体检测试剂判读窗口的T 线、C 线区均出现了紫红色条带，可判读检测结果为2019-nCoV IgM 抗体阳性。如果IgG 抗体检测试剂判读窗口的T 线和C 线区均出现了紫红色条带，可判读检测结果为2019-nCoV IgG 抗体阳性。如果IgM 抗体检测试剂和IgG 抗体检测试剂的判读窗口仅在C 线区出现紫红色条带，可判读检测结果为2019-nCoV 阴性。如果两个判读窗口的C 线区均未出现紫红色条带，则无论判读窗口的T 线区是否出现紫红色条带，均可判读检测结果为无效结果。

1.1.3 优点和局限性 1）胶体金免疫层析法的优点是：操作简便、耗时短，判读检测结果的难度低，适合临床快检。2）胶体金免疫层析法只适用于定性诊断和辅助诊断。临床上应结合患者的临床症状、其他实验室检查的结果综合诊断患者是否发生2019-nCoV 感染。3）在2019-nCoV 感染的初期，患者体内未产生IgM 抗体和IgG 抗体或这两种抗体的滴度均很低，可导致检测的结果呈阴性，易造成漏检，应在7 ～14 d 后再次进行检测。4）对于使用免疫抑制剂进行治疗或免疫功能低下者，其检测结果的参考价值不大。

1.2 酶联免疫吸附法

1.2.1 检测原理 用酶联免疫吸附法检测2019-nCoV IgG 抗体，用重组的2019-nCoV 作为抗原包被微孔板。在微孔板中加入待测样本，如果待测样本中存在2019-nCoV IgG 抗体，会与之相结合，并生成抗原-抗体复合物，进而固定在微孔板上。用洗涤法去除未结合的待测抗体，加入酶标记的抗人抗体（酶标二抗）。此酶标二抗会与之前形成的抗原-抗体复合物相结合，形成酶标二抗-待测抗体-包被抗原复合物。通过洗涤法去除未结合的酶标二抗，再加入底物，在酶的催化下可发生反应并生成蓝色产物。用终止液终止催化反应，微孔内蓝色产物的颜色可变为黄色，颜色的深浅与待测标本中抗体的含量呈正比。采用酶标仪测得吸光度，计算检测样本中抗体的含量，从而确定检测样本中病毒的含量。

1.2.2 检测结果的判定标准 临界值（C.O.）=0.130+ 阴性对照平均OD 值。如果检测样本的OD 值≥临界值，可判定2019-nCoV IgG 抗体呈阳性，反之则为2019-nCoV IgG 抗体呈阴性。

1.2.3 优点和局限性 1）酶联免疫吸附法的特异性强，灵敏度高。2）检测操作繁琐，耗时长，阴性结果不能排除患者发生病毒感染的可能。

2 核酸检测法

核酸检测法主要包括靶标序列识别法、基因测序法。在进行基因测序检测前，需要裂解2019-nCoV，使其释放出核酸。然后提取出RNA。检测样本包括鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液。受到检测成本、效率等因素的影响，基因测序检测法未在临床上普及。本文主要是分析荧光定量PCR检测法（此法属于靶标序列识别法）的原理、检测结果的判定标准、检测方法的优点及局限性。内容如下。

2.1 检测原理

进行荧光定量PCR 检测的原理是RNA 逆转录反应和聚合酶链式扩增反应相结合。提取检测样本中的2019-nCoV核酸，然后逆转录得到互补脱氧核糖核酸（cDNA）。根据2019-nCoV 核酸的序列[7]设计出特异性引物，用来扩增cDNA。Taqman 探针与对应的核酸片段相结合。Taqman 探针的5，端可修饰荧光基团，Taqman 探针的3，端可修饰淬灭基团。基于荧光共振转移效应，Taqman 探针不会发出荧光。在Taq酶的作用下，核酸片段可发生水解，荧光基团会远离淬灭基团，并可发出荧光。在基因序列每次出现扩增时，都会产生荧光信号。根据荧光信号与扩增循环数之间的关系可以得到一条实时扩增曲线。通过反应达到荧光阈值时对应的循环数值（Ct 值）来判断检测的结果。初始检测样本中2019-nCoV核酸的含量越高，Ct 值越小。2019-nCoV 易发生变异，故应检测其RdRp 基因、N 基因、E 基因。

2.2 检测结果的判定标准

1）如果A 检测通道的Ct 值≤43，且有S 型扩增曲线，可判定检测的结果为RdRp 基因阳性；如果A 检测通道的Ct 值＞43，或无数值，可判定检测的结果为RdRp 基因阴性。N 基因、E 基因检测结果的判断方法同上。如果A、B、C、D 检测通道的Ct 值均＞43 或无数值，则表示检测样本的质量出现问题或操作方法错误，应重新采样检测。2）如果RdRp 基因、N 基因、E 基因的检测结果均呈阳性或RdRp基因和其他一个基因的检测结果呈阳性，可判定检测的结果为2019-nCoV 阳性。如果只有RdRp 基因的检测结果呈阳性，则需要重复检测。如果重复检测的结果仍呈阳性，可判定检测结果为2019-nCoV 阳性。如果E 基因或N 基因的检测结果呈阳性且重复检测后的结果也呈阳性，表示检测样本存在其他近源的冠状病毒。如果三个基因的检测结果均呈阴性，可判定检测结果为2019-nCoV 阴性。

2.3 优点和局限性

1）荧光定量PCR 法的优点是：灵敏度高，特异性强，操作简单。逆转录和基因扩增可同时进行，耗时短，避免多次开盖污染检测样本。2）荧光定量PCR 法的局限性是：检测结果易受检测样本的处理方法（采集、转运、储存）、操作方法、实验室的环境等因素的影响。

3 小结

目前，2019-nCoV 感染性肺炎疫情已经在全球范围内迅速扩散，导致进行2019-nCoV 检测的需求量巨增。国内外已经研发出上百种2019-nCoV 检测产品，而且还在不断地推出新的2019-nCoV 检测产品。本文主要介绍了临床应用率较高的三种实验室检测方法。其中，荧光定量PCR检测法具有较高的灵敏度和特异性，是临床上检测2019-nCoV 的“金标准”。胶体金免疫层析法具有操作简便、用时短的优点，适用于现场检测。酶联免疫吸附法也具有较高的灵敏度和特异性，但用时较长，不适合临床快检。临床上没有一种检测方法可以做到零漏检，因此需要根据检测的目的、场所及受检人群选择合适的方法进行2019-nCoV 检测。