IGF-1受体基因rs2229765与绝经后骨质疏松患者骨代谢标志物相关性*

苏 保 彭晓华 罗小辑 唐 可

重庆医科大学附属第一医院 1 骨科 2 康复医学科，重庆市 400016

绝经是女性走向衰老的一个重要特征，其潜在机制为雌激素水平急剧降低进而导致全身各系统发生病理改变[1],其中绝经后骨质疏松症(Postmenopausal osteoporosis, PMO)是老年女性常见的一种全身性骨代谢疾病[2]。据流行病学调查显示，约40%的50岁以上女性会罹患PMO，而骨折是PMO最为严重的并发症，因其高发病率、高致残率以及由此带来的高额医疗花费，逐渐成为一个严重的公共健康问题[2]。

近年来，越来越多的证据表明PMO不仅仅与雌激素水平下降有关，基因的作用同样至关重要[3]。一项基于家系及孪生同胞的研究表明，50%～80%的骨密度受到基因调控[4]。其中胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)作为一个重要的骨代谢调控因子，逐渐成为骨质疏松领域的一个研究热点。目前研究发现IGF-1主要通过结合IGF-1受体(IGF-1R)发挥调解骨代谢的作用，其受体rs2229765位点已被证实与PMO发生密切相关，但其具体机制尚不清楚[5]。本研究将探讨rs2229765位点等位基因频率和基因型频率在PMO患者中的分布特点，并探讨该基因位点多样性与骨代谢标志的相关性，有助于我们从基因水平揭示PMO的发病机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 前瞻性纳入2016年1月—2019年1月间来我院骨科、老年科、妇科门诊就诊的骨质疏松患者180例，列为骨质疏松组；按年龄匹配在体检中心门诊中纳入骨量正常的健康绝经后妇女180例，列为对照组。诊断标准为行双能X线骨密度仪进行腰椎和双髋关节的骨密度测定，其中T值≤-2.5诊断为骨质疏松；T值≥-1.0则表示为骨量正常。(1)纳入标准：①女性年龄≥55岁，且绝经时间≥1年；②无合并其他器官系统疾病；③患者自愿加入本项研究，签署知情同意。(2)排除标准：①绝经年龄过早≤40岁；②继发性骨质疏松，或合并其他影响骨代谢相关疾病，如甲状旁腺功能亢进、库欣综合征、强直性脊柱炎等；③长期服用影响骨代谢的药物如钙、激素、精神类药物等；④临床资料不完整等。

1.2 方法

1.2.1 骨代谢标志物测定：采取空腹静脉血5ml，离心后吸取上清液立即上机检测。采用罗氏全自动化学发光免疫分析仪及相关试剂盒分别检测血清I型前胶原羧基端前肽(Procollagen I N-terminal propeptide,PINP)、I型胶原羧基端β特殊序列(β-crosslaps of collagen cross-linked C-telopeptide,β-CTX)、骨钙素(Osteocalcin,OC)、甲状旁腺激素(Parathyroid hormone,PTH)及25-羟维生素D[25-hydroxyvitamin D，25(OH)D]。

1.2.2 基因多态性分析：空腹抽取静脉血5ml，加入红细胞裂解液离心后弃去上清，留取白细胞沉淀。采用DNA提取试剂盒提取基因组DNA后(Sna)分析基因型。参考既往文献，IGF-1R基因rs2229765位点引物：上游5’-CAGGGGTCGTTTGGGATGGTC-3’,下游 5’-CCTGTGCTGCATTTTGGCTTTTC-3’。PCR反应体系如下：2×PCR Master Mix 12.5μl，ddH2O 9.5μl，DNA1μl，引物各1μl。反应条件如下：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共行30个循环，每一个循环退火温度降低0.5℃；再接着行30个循环：94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸7min。取5μl扩增产物，加酶Mnl 1μl，10×NEB缓冲液5μl，ddH2O 29μl，置于37℃水浴过夜。将反应产物用Gold View染色的琼脂糖(40g/L)中电泳，凝胶成像仪中拍照观察。其中GG纯合子显示3条条带(103bp、84bp、20bp)，AA纯合子显示2条带(123bp、84bp)，GA杂合子显示4条带(123bp、103bp、84bp、20bp)。

2 结果

2.1 患者基线资料 最终有330名受试者纳入本项研究，其中PMO组170例，对照组160例。两组人群在年龄、绝经时间、体重指数方面无显著差异(P>0.05)。但PMO组受试者骨密度明显降低，且PINP和β-CTX的血清水平影响高于对照组(P<0.05)，而IGF-1水平则明显下降(P<0.05)，提示IGF-1与骨代谢水平密切相关。但其他骨代谢相关指标OC、25(OH)D和PTH两组间比较没有差异性，见表1。

表1 两组基线资料比较

2.2 基因型及等位基因分布 结果显示两组rs2229765基因分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡，具有群体代表性。但两组基因型和等位基因分布均存在显著差异，其中PMO组中基因型AA及等位基因A分布明显高于对照组(P<0.05)；而与GG型相比，基因型GA在两组间的分布没有显著差异(P>0.05)，见表2。

表2 两组基因型及等位基因比较(n)

2.3 骨代谢标志物在不同基因型间比较 血清骨代谢标志物在三种基因型间的比较结果显示，血清OC、25(OH)D及PTH浓度在AA、GG和GA三种基因型间无统计学差异(P>0.05)；但血清PINP和β-CTX浓度在GA、AA基因型中均高于GG基因型，且在AA基因型中其浓度最高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 基因型与骨代谢标志物组间比较

2.4 不同基因型与骨密度和骨代谢标志物相关性 进一步运用多因素Logistics回归分析评估rs2229765位点基因型与骨密度和骨代谢标志物的相关性，在调整年龄、绝经时间、体重指数后，结果显示与GG基因型相比，AA基因型妇女股骨颈骨密度降低的风险显著增加(OR=2.13，95%CI:1.65～3.56，P<0.001)；而AA基因型腰椎骨密度虽然也有降低，但差异无统计学意义(OR=1.25，95%CI:0.72～1.97，P=0.071)；而在两个重要骨代谢标志物的分析中发现，AA基因型与β-CTX升高显著相关(OR=2.46，95%CI: 1.65～3.56，P=0.007)，但与PINP升高无显著相关性(OR=1.14，95%CI:0.93～1.22，P=0.169)。这一结果表明在绝经后妇女中，rs2229765与股骨颈骨密度降低和β-CTX升高有着密切联系。

3 讨论

除了年龄相关的骨量流失和雌激素缺乏外，PMO的发病机制亦由基因和环境因素共同决定。胰岛素样生长因子是骨基质中最丰富的生长因子，是一类既能促细胞分化、增殖，又具有胰岛素样作用的多肽物质[6]。在骨组织中，IGF-1主要由成骨细胞分泌，其在生理剂量范围内，可与成骨细胞表面的特异性受体IGF-1R相结合，增加胶原蛋白合成，酸化骨基质有利于成骨；同时可以通过稳定β-连环蛋白减少成骨细胞的凋亡[7]。本项研究同样发现IGF-1血清浓度在PMO组中较对照组显著降低，初步揭示了IGF-1对于骨代谢的重要影响。

IGF-1主要通过其受体发挥对骨代谢的调控作用，近年研究已证实IGF-1R是一种跨膜四聚体糖蛋白，其已发现多种多态性，其中位于第16号外显子的基因位点rs2229765被认为与PMO密切相关[8]。本研究结果同样表明在年龄匹配的PMO和骨量正常受试者中，rs2229765的基因型及等位基因分布评论存在明显差异。进一步相关性分析表明在AA基因型髋关节骨密度显著降低，但腰椎骨密度虽较其他两者有所降低，但未见统计学差异。分析原因随着年龄增长，脊柱退变往往更为明显，容易出现小关节聚集增生，韧带钙化，椎体形态改变、边缘骨质增生等，因此在老年群体中髋关节骨密度更能反映真实的骨质疏松状态[9]。但rs2229765多样性对骨代谢影响的潜在机制值得进一步探讨。

骨代谢标志物可实时反映骨转换状态，灵敏度高、特异性强，可用于抗骨质疏松疗效评价、骨折风险预测等[10]。机体90%的骨基质由Ⅰ型胶原质组成，PINP是Ⅰ型前胶原氨基端的延伸段，其血清含量主要反映Ⅰ型胶原的合成率，是骨形成的主要指标[11]；β-CTX是Ⅰ型胶原分解的产物，是骨吸收的特异性指标[12]。本研究初步结果表明PMO组受试者PINP和β-CTX的血清水平高于对照组，与PMO“高转化”骨代谢特征相符。而对骨代谢物浓度在不同基因型间分析发现，AA基因型中的β-CTX血清浓度显著高于其他基因型。β-CTX在血清中的含量升高反映骨吸收活性增强，提示骨量丢失越严重。最新的荟萃分析结果表明对于PMO妇女，β-CTX较PINP能更好地预测发生骨质疏松骨折的风险。而AA基因型中的β-CTX血清浓度升高也与本项研究中AA基因型髋关节骨密度降低相吻合。

本项研究亦存在一些不足之处，首先该课题是一项横断面研究，单中心且样本量较小，尤其在进行多因素回归分析时容易造成分析偏倚，导致其临床循证学意义较弱；其次由于既往临床资料的局限，所纳入的分析骨生化标志物有限，并不能充分反映出患者的骨代谢状态。

综上所述，本研究初步证明了IGF-1R基因rs2229765多态性与PMO发生密切相关，其潜在机制是升高破骨活性，导致骨流失，从而降低骨密度，为揭示PMO发病机制，在基因水平对PMO进行诊疗提供了新的思考方向。