自噬在胰腺星状细胞激活及纤维化中的作用

李丹，崔立华，李彩霞，张淑坤

(1.天津市南开医院胃肠外科，天津 300100；2.天津市南开医院中西医结合急腹症研究所，天津 300100)

胰腺纤维化是指胰腺组织弥漫性纤维组织增生，呈进行性、不可逆发展，最终导致胰腺内、外分泌功能丧失。这种纤维化与病程进展相伴随，常见于慢性胰腺炎、胰腺癌及胰腺囊性纤维化等疾病。胰腺星状细胞(pancreatic stellate cells，PSCs)，激活是触发胰腺纤维化的扳机，胶原代谢动态失衡即胶原合成增多和(或)降解减少是胰腺实质纤维化的主要病理生理过程。适时终止纤维化进程是临床治疗慢性胰腺炎的难点。自噬是细胞内清除受损、衰老细胞结构的主要方式，同时为细胞重建、再生和修复提供原料。近年有研究发现，PSCs自噬参与其激活过程，抑制自噬能同时抑制PSCs激活。深入研究PSCs自噬及其调控机制可能为胰腺纤维化的治疗提供新靶点和新策略。

一、PSCs激活与胰腺纤维化

1.胰腺纤维化 以胶原为主的细胞外基质成分代谢失衡，并沉积在细胞外将导致胰腺组织纤维化。在正常胰腺组织的基底膜、间质纤维、导管壁和血管壁均可检测到胶原表达，这些胶原是胰腺组织结构的一部分，还参与胰腺细胞与血浆之间的物质交换和信息传递[1-2]。胰腺纤维化时，利用饱和苦味酸-天狼星红染色，在偏振光显微镜下可清晰地观察到Ⅰ型胶原纤维呈亮红色或橙红色，Ⅲ型胶原纤维呈绿色。Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维交织成网络，呈弥漫性分布，致使腺泡萎缩变形。以胶原合成增多和(或)降解减少胶原为主的细胞外基质代谢动态失衡是胰腺纤维化的主要病生理过程。胶原合成受转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)等细胞因子调控[3-4]，胶原的降解主要由基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)调控。目前已发现 MMPs 有26种家族成员，其中属于间质胶原酶类的 MMP1(人)、MMP13(鼠)和 MMP8 主要负责降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原，属于明胶酶类的MMP2和MMP9主要降解Ⅳ型胶原，均与胰腺纤维化关系密切[5-6]。基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)是组织中 MMPs 的内源性特异性抑制因子。目前已发现的 TIMPs 包括 TIMP1、2、3、4 四种，它们分别与 MMPs 形成二元或三元复合物，在时间和空间上共同抑制 MMPs 的活性，阻止胶原降解，促进胰腺纤维化[7]。

2.PSCs PSCs有静息态和激活态两种表型。在正常胰腺组织中，PSCs约占胰腺细胞总数的4.0%，呈静止状态，位于腺泡基底部和胰腺小叶间，胞质内储存丰富脂滴，中间丝蛋白和神经胶质酸性蛋白表达阳性[8]。当胰腺坏死、炎症发生时，原本处于静止状态的PSCs被激活，转化为类肌成纤维样细胞，其形态和功能均发生明显变化:胞质内脂滴消失，体积变大，增殖活跃，合成并分泌大量的炎性细胞因子和细胞外基质成分(如Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白，纤维连接蛋白，层黏连蛋白等)，α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达阳性，具有收缩和移行能力[9]。PSCs除了在胰腺修复损伤中发挥间质支持作用外，近年还被发现具备干细胞的一些特性，例如，在大鼠的胰腺组织中可分离出表达干细胞标志物(如CD133、PITX2)的PSCs，提示PSCs还参与胰腺组织再生过程[10-11]。

3.PSCs激活与胰腺纤维化 激活PSCs是触发胰腺纤维化的扳机。尽管胰腺纤维化的发病机制还没有完全阐明，但研究者普遍认为胰腺实质细胞损伤、坏死、炎细胞浸润是激活PSCs的必需和先决条件[12-14]。激活PSCs旨在修复受损胰腺组织，但同时也启动了胰腺纤维化。处于激活状态的PSCs如果继续保持旺盛的增殖能力，持续合成和分泌大量细胞外基质成分，就会干扰胶原代谢动态平衡，即胶原合成增多和(或)降解减少，将导致胰腺纤维化，破坏正常组织结构，影响胰腺功能。已有研究证实，TGF-β1、血小板衍生生长因子BB(platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB)、乙醇及其代谢物等细胞外刺激因素能通过MAPK、Smads及Wnt等信号通路，参与PSCs激活过程，上调Ⅰ型胶原等靶基因转录和翻译[15-17]。这些信号通路在胰腺纤维化过程中被证实处于失调控状态，进一步导致激活态PSCs合成、分泌大量的细胞因子和细胞外基质成分，促进纤维化进程。还有研究从胶原降解角度研究胰腺纤维化，发现MMP13和TIMP1 在二丁基二氯化物诱导的慢性胰腺炎纤维化大鼠表达升高[18]。

二、PSCs自噬与激活

1.自噬 自噬是一种细胞内经典代谢过程,是降解、清除细胞内受损的细胞结构、衰老的细胞器以及不再需要的生物大分子物质的主要方式，同时也为细胞重建、再生和修复提供氨基酸、脂肪酸等原料,实现营养物质的循环利用。自噬过程是由一套自噬相关基因(autophagy-related gene, Atg)编码的蛋白所调控的动态过程。在酵母中已发现的Atg已超过30种，其中15种核心Atg(Atg1～Atg10,Atg12～Atg14, Atg16 和Atg18)在哺乳动物也相继被发现。自噬过程可分为3个步骤：①起始：Atgl3与ULK、FIP200形成复合物，启动自噬，在胞质的某处形成一个小的扁平的双层膜结构——吞噬泡；②延伸：在Atg3、Atg5、Atg7、Atg10、Atg12和微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)等参与下，吞噬泡不断延伸，将胞质中成分揽入其中，然后收口成为密闭的自噬体；③融合和降解:自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，自噬体的内膜被溶酶体酶降解，两者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物(氨基酸、脂肪酸等)被输送到胞质中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞质中[19-20]。

2.PSCs自噬与激活 Endo等[21]从手术切取的胰腺癌和慢性胰腺炎组织中分离、培养病人的PSCs，发现激活态的PSCs存在自噬现象，且来源于胰腺癌组织PSCs的自噬水平比来源于慢性胰腺炎组织的高；接着在二丁基二氯化物诱导的慢性胰腺炎动物模型也观察到PSCs自噬水平升高[22]，这些研究提示自噬在PSCs激活以及胰腺纤维化的发生发展中起重要作用。还有研究表明PSCs通过自噬产生的丙氨酸可以作为一种替代碳源，为胰腺癌细胞提供原料，有助于在其相对贫瘠的微环境中获得能量，快速生长[23]。Li等[22]用透射电镜在体外原代培养的大鼠PSCs观察到胞质内具有典型双层膜结构的自噬体，并发现随着原代培养时间的延长,自噬标志物LC3B和激活标志物α-SMA在PSCs表达同步增强；为进一步探讨PSCs自噬和激活的关系，用含3-甲基腺嘌呤(3-MA)的培养液孵育原代PSCs，发现LC3、Atg 5和α-SMA 的mRNA 和蛋白表达同时降低，这一研究首次证实自噬参与PSCs激活过程，抑制PSCs自噬能同时抑制其激活。但对于自噬在PSCs由静息态转变成激活态过程中所起的作用还没有定论。有研究推测，PSCs可能通过自噬降解储存在胞质内的脂滴，为静息态PSCs提供原料和能量，促进PSCs激活[23]。

三、自噬的调控与PSCs激活及胰腺纤维化

1.PSCs自噬相关信号通路 哺乳动物雷帕霉素作用靶点(mammalian target of rapamycin,mTOR)在调节蛋白质合成、细胞周期分布、细胞增殖及凋亡等多个方面发挥重要作用,同时也是调控细胞自噬活性高低的“枢纽”。当mTOR被抑制时，Atg13与ULK、FIP200结合，诱导自噬发生；反之当mTOR被活化后，抑制自噬启动[24]。最近有研究发现，PI3K/Akt/mTOR通路在慢性胰腺炎大鼠被抑制，而TGF-β1/Smads通路被激活，同时伴有胰腺组织自噬活性增高和纤维化；利用体外培养的PSCs进行深入的机制探讨，发现PI3K/Akt通路抑制剂LY294002能进一步促进TGF-β1表达、PSCs自噬和激活[25]。这一研究提示PI3K/Akt/mTOR和TGF-β1/Smads两条通路之间存在相互作用，抑制PI3K/Akt/mTOR通路除了能直接促进PSCs自噬，还能通过促进TGF-β1/Smads通路促进PSCs激活，加速胰腺纤维化进程。除此之外，TGF-β1对ULK1磷酸化有抑制作用，使之易于与FIP200、Atgl3结合，诱导PSCs自噬发生[26]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase，AMPK)/mTOR是调控细胞能量代谢的主要通路，也参与了PSCs的自噬过程的调控[27]。还有研究表明，视网膜母细胞瘤卷曲螺旋蛋白1(retinoblastoma coiled coil protein 1，RB1CC1)在慢性胰腺炎纤维化病人表达升高，沉默RB1CC1基因能抑制ULK1的表达及其激酶活性，进而抑制激活态PSCs的自噬作用，减少胶原分泌。进一步研究发现，RB1CC1能与ULK1 mRNA启动子区域结合并相互作用，上调其mRNA和蛋白表达，这可能是RB1CC1促进PSCs自噬发生的分子机制[26]。

2.PSCs自噬的调控 最近有研究发现一些药物对PSCs自噬有调控作用。柴胡皂苷d是中药柴胡的主要有效成分之一，Cui 等[28]探讨了胡皂苷d对PSCs自噬和活化的影响，发现SSd对PSCs自噬和活化有抑制作用，其抗胰腺纤维化的作用机制是通过激活PI3K/Akt/mTOR途径抑制PSCs自噬，从而抑制其激活、减少胶原生成实现的。还有研究[29]发现辅酶Q10也能激活PI3K/Akt/mTOR通路，阻止胰腺纤维化进程。FTY720是由冬虫夏草提取物中多球壳菌素进行化学修饰而成的免疫抑制剂，有研究发现FTY720能抑制PSCs自噬和激活，使其细胞活力、增殖和迁移能力降低；AMPK激动剂phenformin能激活AMPK/mTOR通路，上调自噬标志物LC3B蛋白表达，而FTY720能对抗phenformin的激活作用，下调LC3B表达。这些结果表明FTY720通过抑制AMPK/mTOR通路来抑制PSCs自噬，进而抑制其激活和减轻胰腺纤维化程度[27]。

四、小结与展望

综上所述，适度抑制PSCs的激活程度，使之合成的胶原既能修复损伤组织，又不在细胞外沉积，是阻止胰腺纤维化进展的关键。自噬在PSCs激活过程中起重要作用，可能与降解脂滴、提供能量有关，抑制PSCs自噬能同时抑制PSCs激活。目前研究表明PI3K/Akt/mTOR和AMPK/mTOR通路、自噬启动复合物的形成是调控PSCs自噬活性的关键，深入研究PSCs自噬及其药物调控机制可能为胰腺纤维化的治疗提供新靶点和新策略。