重组单克隆抗体电荷异质性和工艺调控

王欢,牛昆,江一帆,董静

华北制药新药研究开发有限责任公司, 抗体药物研制国家重点实验室, 石家庄 050015

近年来，生物制药发展迅速，2019年全球药物销售Top10的药物中有7个为抗体或融合蛋白。在生物药物研发过程中，由于存在翻译后修饰，抗体药的质量控制显得尤为重要。在研发人员重点关注的质量属性中，电荷异质性是关键质量属性(critical quality attributes，CQA)之一。电荷异质性来源于蛋白质的翻译后修饰，如末端的改变、糖基化[1-2]、脱酰氨基作用[3]、异构化、氧化、分裂、聚合等[4]都会引起表面电荷的改变。电荷异构体是因电荷改变的修饰后蛋白质，可以通过基于电荷差异的纯化方法分离出主峰、酸性峰和碱性峰三部分。对应酸性峰和碱性峰的，分别是酸性物质和碱性物质，与主要成分(对应主峰)相比，可能对应不同的临床效果。

本文通过综述重组单克隆抗体产生电荷异质性的表征方法、原因及对药效和安全性的影响，阐述了电荷异质性调控的必要性。通过总结工艺上下游调控策略，希望为生物药物工艺开发研究提供有关单抗药物电荷异质性常见问题的解决思路。

1 重组单克隆抗体电荷异质性的表征

重组单克隆抗体的电荷异质性表征方法主要有等电聚焦电泳(isoelectric focusing, IEF)和离子交换层析(ion exchange, IEX)[5-6]。

等电聚焦电泳(IEF)根据分子的等电点(pI)和总电荷分离抗体，一般用280 nm处紫外吸收实现检测。离子交换层析(IEX)是解决电荷异构体的另一种主要技术，由于许多治疗性抗体具有碱性pI值，因此阳离子交换层析(cation-exchange,CEX)是最常用的IEX技术。

重组单克隆抗体可基于以上纯化或分析方法分离成酸性成分、主要成分和碱性成分。主要成分在主峰位置出峰；酸性物质在IEF低于pI,CEX早于主峰，或AEX晚于主峰；碱性物质在IEF高于pI，CEX晚于主峰，或AEX早于主峰。

在抗体药质量表征过程中，还可以使用液相色谱-质谱(LC-MS)或酶处理加色谱分析的方法对电荷异构体形成原因进行进一步的分析[7]。

2 重组单克隆抗体电荷异质性产生的蛋白修饰

2.1 主要成分

主要成分的翻译后修饰一般包括N端的谷氨酰胺环化成为焦谷氨酸、去除重链C端的赖氨酸、CH2区域Asn链接的糖型为中性。

2.1.1N端的谷氨酰胺环化成为焦谷氨酸 有些抗体的重、轻链N端第一个氨基酸为谷氨酰胺，该谷氨酰胺通常会以焦谷氨酸环化形式存在。带有焦谷氨酸环化的抗体，会在主峰洗脱[8]，未发生环化的谷氨酰胺在碱性峰洗脱。

2.1.2去除重链C端的赖氨酸 羧肽酶去除重链C端赖氨酸，使抗体存在0、1或2个赖氨酸。没有C端赖氨酸的抗体在主峰洗脱，但也存在有两个C端赖氨酸的抗体出现在主峰的报道[8]。

2.1.3CH2区域Asn链接的糖型为中性 在CH2区域保守的Asn297有对称的N连接的低聚糖。哺乳动物细胞培养表达的重组抗体的主要糖型为有或无核心岩藻糖的双天线结构，有1、2个或没有末端的半乳糖残基[9]。

2.2 酸性物质的蛋白修饰

抗体唾液酸修饰和天冬氨酰(Asn)脱酰胺是产生酸性物质的主要原因[8，10]，前者已经被广泛报道，形成的原因在于唾液酸本身存在的阴离子[11]。后者通过引入阴离子导致酸性物质的出现，常发生在抗体可变区，尤其发生在暴露和容易发生形变的CDR(互补决定区)区域[11-12]，结果是产生天冬氨酸(Asp)或异天冬氨酸(isoAsp)，且CDR区域的柔性会导致抗体不同CDR之间发生相互影响[13]。

除此之外，还存在其他造成酸性物质产生的原因，如：还原糖醛基与侧链或N端的赖氨酸、组氨酸或精氨酸等氨基酸的氨基发生化学反应[14]；非典型二硫键连接[15]；抗体含有三硫键或高甘露糖成分[16-17]；马来酸修饰重链和轻链N端氨基而产生酸性物质；重组抗体重链CDR3的Cys104可能发生半胱酰胺化反应[18]；抗体具有还原二硫键[14]或者非还原成分以及一系列抗体裂解碎片等[17,19]。

2.3 碱性物质的蛋白修饰

抗体产生碱性物质的主要原因是C端赖氨酸的去除和天冬氨酸的异构化。抗体C端赖氨酸的去除是被报道最多的形成碱性物质的原因[8,20-21]，这是由于羧肽酶B切除C端赖氨酸不彻底从而形成碱性物质。琥珀酰亚胺(Asu)是天冬氨酸(Asp)异构化的常见中间产物，Asu的产生也是形成碱性物质的主要原因，但Asu也可能通过蛋白质构象的明显改变而产生酸性物质[22]。

其他造成碱性物质产生的原因，如：N端谷氨酰胺环化成焦谷氨酸时，环化作用不完全导致形成含有最初谷氨酰胺的抗体；温度及光照均会导致甲硫氨酸氧化，进而通过影响临近氨基酸电离程度导致碱性物质的出现[11]；抗体重链C端序列为脯氨酸-甘氨酸-赖氨酸(PGK)时，末位赖氨酸被切除后导致脯氨酸酰胺化[23]；重链可变区有未成形的二硫键[24]抗体信号肽的不完全去除[8，14],重组单抗轻链丝氨酸到精氨酸或发生在重链Fc区域的氨基酸突变[10]；含有一个糖基化修饰的重链和一个具有短寡糖重链的抗体在CEX作为碱性物质洗脱[25]；非共价的Fab-Fab二聚体[26]；抗体的聚体[14,26]和碎片[19]等。常见的能够导致电荷异质性产生的抗体修饰见图1。

图1 导致电荷异质性的抗体修饰[27]Fig.1 Modification of antibodies that cause charge heterogeneity[27]

3 产品安全性和有效性的影响

报道指出，减少酸性物质比减少碱性物质更为重要[28-29]。相比于碱性物质，酸性物质会造成单抗药物体内滞留时间减少和血液清除率加快，且对药效不利，如曲妥珠单抗的酸性变异体与HER2的结合能力较低[30]。碱性物质多对药效产生正面影响，如在很多情况下，碱性变异体显示出更强的亲和力及更强的ADCC效应。但一般认为等电点(pI)差异大于1的蛋白产品在组织分布和代谢动力学方面会产生较大的差异[31]。

导致电荷异质性产生的各种修饰对抗体结构、稳定性和生物功能的潜在影响在很大程度上取决于它们的修饰位置。N端或C端的抗体修饰，如赖氨酸的去除和谷氨酰胺的焦谷氨酸环化一般不会对抗体的结构及稳定性产生实质影响，也不会影响抗体的CDC及ADCC效应[21]，因为这些位置高度暴露，不是任何配体结合位点的一部分。在N端、C端以外区域的修饰更可能对结构、稳定性和生物功能产生实质性的影响[13]。CDR区天冬酰胺脱氨基作用会导致重组抗体-抗原结合力下降，原因可能是因为脱氨基作用导致抗体-抗原不能结合或亲和力下降[13，17]；同样，由天冬酰胺脱氨基作用导致的蛋白异天冬氨酸化可能使蛋白原有氢键被打破及CDR区域柔性下降[13]。重链CDR3区域Cys104的半胱酰胺化导致抗体热稳定性下降，更容易形成聚集物。非经典二硫键的作用因抗体而异，在效价测定中，IgG2B的效价与IgG2A相同或更低[32]。同时研究报道，铰链区存在三硫键不影响IgG2抗体的热稳定性[16]。

一般认为唾液酸不会对抗体的效价造成影响。而Fc区临近于多个配体结合位点的Met残基氧化可以减少protein A、protein G和FcRn结合性，但对Fcγ受体结合影响很小[33-34]。此外，Met残基的氧化导致了体内半衰期的显著降低[35]及抗体热稳定性下降[36]，并增加了形成聚体的倾向[37]。

上文提到的修饰对抗体结构和功能的影响，但需要评估总的电荷异质性带来的复合影响。一个IgG1单抗的修饰可能轻微影响抗原结合，但可能不影响药效和体内PK，对于质量研究人员来说，同时收集相应的组分展开研究是有必要的。

4 重组单克隆抗体电荷异质性的工艺调控

4.1 上游调控策略

在抗体研发上游阶段存在多种手段对抗体电荷异质性进行调控(表1)，基因组学的方法成功解决了很多关于产品表达和质量的问题，如通过改变酶活性来达到唾液酸修饰调节的目的，从而控制产品的电荷；对羧基肽酶活性的研究也成功通过调控C端氨基酸残基缺失控制抗体基本电荷的变化[41-42]。

但是许多电荷变异修饰是由于细胞外相互作用以分子依赖的方式发生的，很难预测和控制。因此培养工艺和培养基的控制是调节电荷异质性的常用方法。

大量参数都会对碱性峰造成影响，包括温度、pH、溶氧和接种密度。其中pH影响较大，被认为是关键参数[43-45]，如随着pH的增加，天冬酰胺脱氨基反应速率也明显增加[13]；但温度是唯一可以显著降低酸峰的参数，原因可能在于降温可以降低羧基肽酶B的转录水平，增加赖氨酸变异体数量，从而减少酸性物质的形成。

培养基成分对电荷有着重要影响，在化学成分限定培养基中，铜离子浓度升高，锌离子浓度降低，抗体C末端赖氨酸变异体会增加；增加丙三醇、氯化钠和金属离子浓度，抗体脱酰胺作用会增加；丁酸钠虽然增加抗体表达量，但电荷异质性也会增加，特别是碱性物质；生物类黄酮家族物质会减少抗体的酸性物质；硫代硫酸盐会与抗体反应形成酸性物质。

4.2 下游调控策略

离子交换层析(IEX)是分离电荷变异体的首选纯化技术，分离方法一般围绕树脂的选择和洗脱方式的优化(通常是盐浓度和pH梯度)[40,46]。固定相的设计需要满足行业内规范，色谱层析柱需要根据目的蛋白的载量和蛋白结合力进行选择。

膜层析主要用于分离电荷变异体[47]、聚体[48]和宿主细胞蛋白[49]。其主要限制因素在于结合能力较低。目前，提高结合能力有助于膜层析技术广泛应用于电荷变异体分离。

表1 抗体电荷异质性上游调控手段[38-40]Table 1 Upstream regulation of antibody charge heterogeneity[38-40]

混合模式色谱允许在高盐浓度、高载量、宽操作窗口和高选择性条件下操作，能够将电荷变体杂质分离成单独的峰[50]。但由于成本高、优化过程复杂，且应用集中在解决聚体问题[51-52]，因此一般作为备选方案。

洗脱模式的设计有很强的灵活性，通常有两种洗脱方式调控电荷异质性：盐浓度梯度洗脱和pH梯度洗脱。前者是最常见的洗脱方式[53]，通过带电荷的盐离子与结合蛋白以浓度依赖的方式竞争树脂的官能团；后者利用在离子强度，蛋白质等电点(pI)附近的pH，在AEX模式下，高于蛋白等电点，而CEX模式下，低于等电点。工业操作可以实现逐级盐或pH梯度。然而，这种策略可能会增加操作周期的总数和整个单元的操作时间，从而增加成本[54]。

由于生产规模的产能限制，利用纯化手段分离电荷变体的能力仍然有限。更深刻地理解对蛋白质结合和缓冲液相互作用和建立模型，将会大大改善下游过程的电荷变化控制，减少过度依赖大型DOE，以确定整个纯化工艺。

5 讨论

目前已知的蛋白质翻译后修饰超过300种，其中很多修饰可能影响蛋白的功能和性质，但只有少数翻译后修饰研究比较深入。翻译后修饰造成的电荷异质性可能会影响药效及造成意外的副作用，因此保持电荷一致性是非常重要的。但是，由于目前对电荷变化原因的理解仍然不足，因此关于电荷异质性的调控方法虽有陆续报道，但由于相对复杂，即使确定产生原因，成功调控到理想的范围也可能十分困难。因此单抗药物电荷异质性的调控是一个关键的挑战，其研究应贯穿整个生物药物的开发阶段，包括细胞株的构建和确定、细胞培养工艺、收获、纯化和分析表征。

对于质量研究人员来说，需要根据项目的特点应用适宜的技术对于抗体电荷异质性产生原因的表征并进行深入研究。工艺开发人员需要根据质量人员的研究结果反馈，选择是否需要采用工艺等手段对电荷异质性进行调节。

整个培养工艺优化过程，一般是先确定培养基，通过确定基础培养基对补料进行调整来调整关键质量属性，也可以确定补料对基础培养基进行混合或替换，或者通过简单的梯度实验找到关键工艺参数然后重点研究，再根据项目特点选择是否需要进行交互作用研究的实验。在这些工作完成以后可以根据质量结果进行分析，再有的放矢的进行调节。

工艺部门需要质量部门的协助，正确的对生物药进行表征会使工艺开发过程有明确的方向性。什么时候进行质量分析以及分析的程度是一个值得思考的问题，一方面，质量研究开展的越早越好，研究深度越深越好，但相应的成本也越高，周期也越长。另一方面前期较少的样本量无法支持质量分析，加上酸碱峰成分的表征方法也相对复杂，需要根据经验进行，一般要做多轮次实验，很难做到快速检测，所以前期开发主要还是使用离子色谱等手段，根据项目的推进，逐步开展深度的工艺表征。