蜂蛹多肽对巨噬细胞RAW264.7免疫活性的影响

赵杰,张伟杰,陈瑶,项清芳,赵婷,茆广华,冯伟伟,仰榴青*

1.江苏大学化学化工学院, 江苏 镇江 212013; 2.江苏大学食品与生物工程学院, 江苏 镇江 212013; 3.江苏大学环境与安全工程学院, 江苏 镇江 212013

蜂蛹(bee pupa)为胡蜂、黄蜂、黑蜂、土蜂等野蜂的幼虫和蛹，蜂蛹含有丰富的蛋白质、脂肪和微量元素等营养物质，具有增进食欲、改善睡眠、增强体质、提高机体免疫力等功效[1]。蜂蛹中蛋白质含量达35%～45%，且含有赖氨酸、苏氨酸和亮氨酸等8种必需氨基酸，是一种优质的天然蛋白质资源[2]。蜂蛹多肽具有抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等生物学活性。研究表明，蜂蛹多肽纯化组分Ⅳ可较好的清除DPPH·自由基、ABTS+·自由基、超氧阴离子和羟基自由基，同时具有螯合Fe2+的能力，说明蜂蛹多肽具有较强的抗氧化能力[3]。胡福良等[4]研究蜂蛹对小鼠S180肿瘤生长的抑制作用，结果表明，蜂蛹的抑瘤率为64.37%，能显著延长S180腹水癌荷瘤小鼠的存活期。何娟等[5]采用环磷酰胺免疫抑制小鼠模型，研究了高、中、低3个剂量的雄蜂蛹多肽的免疫活性，结果表明，高剂量雄蜂蛹多肽可明显提高环磷酰胺模型小鼠的白细胞数、网织红细胞数和有核细胞数，并能明显提高有核细胞的DNA合成，表明雄蜂蛹多肽提取物对小鼠具有一定的免疫增强作用。但关于蜂蛹多肽纯化组分的体外免疫调节活性的研究尚未见报道。

免疫应答是指机体受抗原性物质刺激后，免疫细胞发生一系列反应以排除抗原性异物的过程。巨噬细胞是构成机体免疫系统中免疫细胞的重要成员之一，在免疫系统中发挥着较为重要的作用，如免疫防卫和维稳等，在免疫应答过程中，巨噬细胞是最先做出反应的细胞种类之一[6]。被激活的巨噬细胞具有吞噬能力，并通过分泌各种免疫活性物质，加速细胞的免疫反应[7-8]。巨噬细胞RAW264.7是被用来研究免疫调节的常用细胞株[9]。

免疫调节剂是通过增加、减少或修改机体的免疫反应来改变先天免疫和获得性免疫体系的一类物质[10]，蜂蛹多肽是将天然蛋白质酶解得到的，对机体无毒副作用，因此，对蜂蛹多肽免疫调节活性的研究具有重要意义。本课题组在前期研究中经酶解、纯化获得了一种蜂蛹多肽纯化组分BPP-21(数据未发表)，本研究通过考察BPP-21对巨噬细胞RAW264.7的细胞活力、吞噬能力、细胞因子分泌能力、NO分泌能力和氧化应激指标的影响，来探究蜂蛹多肽的免疫调节活性，以期为研究与开发蜂蛹多肽免疫调节剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

BPP-21是本课题组在前期研究中由碱性蛋白酶水解蜂蛹蛋白、经DEAE-Sepharose Fast Flow和Sephadex G-25凝胶柱分离纯化得到的纯化组分(数据未发表)；小鼠巨噬细胞系RAW264.7购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所；凝胶电泳试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和DMEM培养基购自美国GIBCO公司；白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、干扰素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)酶联免疫试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自合肥博美生物技术有限责任公司；NO、细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)的检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；其他试剂均为分析纯，购自国药集团。

1.2 主要仪器与设备

Synergy H4型多功能酶标仪(美国Biotek仪器有限公司)；MACO-18AIC型孵箱(日本三洋公司)；SW-CJ-IFB型超净工作台(江苏苏净集团)；37XC倒置生物显微镜(上海彼爱姆光学仪器制造有限公司)。

1.3 细胞培养流程

细胞复苏：将RAW264.7细胞的冻存管从-80 ℃冰箱中取出，将冻存管中的细胞悬液转入离心管，添加少量培养液，1 500 r·min-1离心5 min，去除上清液，再加入含10% FBS的DMEM培养基，混匀后移入培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中进行培养。

细胞传代：在超净台中弃去培养瓶中的培养液，加入含10% FBS DMEM培养基，混匀后吸取细胞悬液，转入新的培养瓶中，摇匀，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。

细胞冻存：取对数生长期细胞，在超净台中弃去培养瓶中的培养液，再加入含10% FBS高糖培养基，吹打均匀，转移至离心管中，1 500 r·min-1离心5 min，去除上清液，加入冻存液，混匀后立即吸入冻存管中，冻存备用。

1.4 BPP-21对RAW264.7细胞活力的影响

选用正常传代的RAW264.7巨噬细胞，用倒置显微镜观察细胞密度，调整细胞密度为1 mL细胞悬液中含有2×105个细胞，取灭菌的96孔板，每孔加入100 μL细胞悬液，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h。观察细胞生长状况，若细胞完全贴壁生长，则移除细胞培养液，空白组每孔加入100 μL培养液，实验组每孔加入100 μL不同浓度(12.5、25、50、100和200 μg·mL-1)BPP-21溶液，模型对照组每孔加入100 μL 10 μg·mL-1脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)溶液[11-13]，每个处理设置6个平行实验。在细胞培养箱中培养6、12、24、48 h后，观察细胞生长状况，若生长状况良好，每孔加入20 μL 1 mg·mL-1MTT溶液继续培养4 h，小心弃去上清液，每孔加入150 μL DMSO，待完全溶解后于570 nm处测定OD值。

1.5 BPP-21对RAW264.7细胞吞噬能力的影响

细胞的选择、密度的调整、加样的浓度与方式以及细胞培养方法同1.4。培养24 h后，取出96孔板，小心弃去细胞培养液，每孔加入100 μL 0.05%中性红溶液，置于培养箱中继续培养4 h。随后，弃去上清液，用PBS溶液清洗3遍，每孔再加入150 μL细胞裂解液，于4 ℃静置2～3 h，待细胞完全裂解后于540 nm处测定OD值。

1.6 BPP-21对RAW264.7细胞分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ量的影响

调节细胞密度为1 mL细胞悬液中含有2×105个细胞，接种于24孔板，每孔加500 μL细胞悬液，培养24 h后，小心弃去上清液，空白组每孔加入500 μL培养液，实验组每孔加入500 μL不同浓度(12.5、25、50、100和200 μg·mL-1)BPP-21溶液，模型对照组每孔加入500 μL 10 μg·mL-1LPS溶液。培养24 h后，收集上清液，按ELISA试剂盒说明书要求测定各细胞因子水平。

1.7 BPP-21对RAW264.7细胞分泌NO量的影响

细胞的选择、密度的调整、加样的浓度与方式和细胞培养方法同1.6。细胞培养24 h后，取出24孔板，收集上清液，按照NO检测试剂盒要求测定NO含量。

1.8 BPP-21对RAW264.7细胞内SOD活力和MDA含量的影响

调节细胞密度为1 mL细胞悬液中含有2×105个细胞，接种于6孔板，每孔加2 mL细胞悬液，培养24 h后，小心弃去上清液，空白组每孔加入2 mL培养液，实验组每孔加入2 mL不同浓度(12.5、25、50、100和200 μg·mL-1)BPP-21溶液，模型对照组每孔加入2 mL 10 μg·mL-1LPS溶液。培养24 h后，小心弃去上清液，用PBS溶液洗3遍，每孔加入300 μL细胞裂解液，用细胞SOD和MDA的检测试剂盒测定SOD活力和MDA含量。

1.9 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 BPP-21对RAW264.7细胞活力的影响

细胞活力通常采用MTT法进行检测，图1为不同浓度(12.5、25、50、100和200 μg·mL-1)BPP-21及10 μg·mL-1LPS分别作用6、12、24和48 h对细胞活力的影响。由图1可见，与空白组相比，BPP-21在不同浓度下作用6、12、24和48 h对细胞活力均无显著影响。结果说明BPP-21不会对细胞产生损伤，造成细胞凋亡。

注：不同小写字母表示同一作用时间内不同处理间的差异在P<0.05水平上具有统计学意义。图1 BPP-21对RAW264.7细胞活力的影响Fig.1 Effect of BPP-21 on the viability of RAW264.7 cells

2.2 BPP-21对RAW264.7细胞吞噬能力的影响

巨噬细胞在炎症的发生、维持、宿主防御等方面起着至关重要的作用[14]，其吞噬功能是机体最重要的非特异性免疫反应之一。图2为BPP-21对RAW264.7细胞吞噬能力的影响。与空白组和LPS组相比，在25～200 μg·mL-1浓度范围内，BPP-21显著提高了巨噬细胞的吞噬能力(P<0.05)。说明BPP-21可激活巨噬细胞，显著增强其吞噬能力。

2.3 BPP-21对RAW264.7细胞分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ水平的影响

当机体受到炎症损伤和外在病原体攻击时，会引起细胞分泌IL-6、TNF-α等细胞因子。活化的巨噬细胞可产生多种细胞因子来调节细胞和体液免疫反应，如TNF-α、IL-2和IFN-γ[15-16]。图3为BPP-21对RAW264.7细胞分泌 IL-2、TNF-α和IFN-γ的影响。结果表明，与空白组相比，BPP-21可一定程度上促进RAW264.7细胞分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ，BPP-21在25～200 μg·mL-1浓度下可显著提高IL-2和TNF-α的分泌量(P<0.05)，在12.5～200 μg·mL-1浓度下可显著提高IFN-γ的分泌量(P<0.05)；与LPS组相比，BPP-21在200 μg·mL-1浓度下显著提高IL-2的分泌量(P<0.05)，在100和200 μg·mL-1浓度下可显著提高TNF-α和IFN-γ的分泌量(P< 0.05)。说明BPP-21可激活RAW264.7细胞，使其IL-2、TNF-α和IFN-γ的分泌量显著增加。

2.4 BPP-21对RAW264.7细胞分泌NO水平的影响

NO是一种细胞内信号分子，不仅参与许多生理和病理活动，而且是巨噬细胞破坏细菌和肿瘤细胞的主要媒介。因此，NO可作为测定巨噬细胞活化的定量指标[17]。图4为BPP-21对RAW264.7细胞分泌NO的影响。结果表明，与空白组相比，BPP-21在12.5～200 μg·mL-1浓度下显著增加了巨噬细胞NO的分泌量(P<0.05)；与LPS组相比，BPP-21在100和200 μg·mL-1浓度下显著提高了NO的分泌量(P<0.05)。说明BPP-21可显著增强RAW264.7细胞分泌NO的作用。

2.5 BPP-21对RAW264.7细胞内SOD活力和MDA含量的影响

SOD活力表示对自由基的清除能力，可评价抗氧化应激能力[18]。MDA是最稳定的次生脂质过氧化产物之一，它在细胞中引起毒性应激，导致组织损伤，而且MDA已被用作细胞中氧化应激的生物标志物，并已报道存在于多种食品中[19-20]。图5为BPP-21对RAW264.7细胞内SOD活力和MDA含量的影响。与空白组和LPS组相比，在浓度为50～200 μg·mL-1时，细胞SOD活力显著升高(P<0.05)；BPP-21对RAW264.7细胞内MDA的含量无显著影响。说明BPP-21可不同程度提高RAW264.7细胞内SOD的活力，并对细胞无明显氧化损伤作用。

注：不同小写字母表示各处理间的差异在P<0.05水平上具有统计学意义。图2 BPP-21对RAW264.7细胞吞噬能力的影响Fig.2 Effect of BPP-21 on the phagocytosis of RAW264.7 cells

注：不同小写字母表示各处理间的差异在P<0.05水平上具有统计学意义。图3 BPP-21对RAW264.7细胞分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ的影响Fig.3 Effects of BPP-21 on inducing IL-2, TNF-α, IFN-γ production of RAW264.7 cells

3 讨论

本文研究了蜂蛹多肽纯化组分BPP-21对RAW264.7巨噬细胞的免疫活性的影响。结果表明，在浓度12.5～200 μg·mL-1范围内，BPP-21对RAW264.7巨噬细胞无明显的细胞毒性作用，并显著提高IFN-γ与NO的分泌量；在浓度25～200 μg·mL-1范围内，显著增加细胞吞噬能力、IL-2与TNF-α的分泌量；在浓度50～200 μg·mL-1范围内，显著提高细胞内SOD的活力。说明BPP-21对RAW264.7巨噬细胞具有较好的免疫调节活性。

巨噬细胞作为吞噬细胞，广泛分布于全身，在宿主防御中起着重要作用，通过其吞噬功能、细胞毒性和细胞内杀伤活性在机体内发挥免疫调节作用[21]。活化的巨噬细胞不仅能够吞噬病原体，还可以分泌调节免疫反应的细胞信使，如炎性介质NO、细胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ。董晓泽[22]研究了日本黄姑鱼皮活性肽对RAW 264.7细胞的免疫活性，结果表明，日本黄姑鱼皮活性肽对RAW 264.7细胞吞噬能力、NO分泌能力和TNF-α、IL-6、IL-12分泌能力的提高具有显著的促进效果。本研究表明BPP-21对RAW 264.7细胞的吞噬能力以及分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ和NO的能力具有显著促进作用，说明BPP-21具有较好的免疫活性。

注：不同小写字母表示各处理间的差异在P<0.05水平上具有统计学意义。图4 BPP-21对RAW264.7细胞分泌NO的影响Fig.4 Effect of BPP-21 on the secretory NO of RAW264.7 cells

机体产生自由基与脂质发生过氧化反应生成MDA，MDA参与脂质自由基的形成和氧的摄取，是内源性脂质过氧化物的标志[23]，测定MDA的量可间接反应细胞损伤的程度。SOD是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，还能够修复受损细胞，复原自由基对人及动植物机体造成的损伤[24]。本研究表明BPP-21可提高RAW264.7细胞内SOD的活力，对MDA的含量无显著影响，说明BPP-21对RAW264.7细胞无明显氧化损伤作用，且可以修复受损细胞、恢复氧自由基对细胞的氧化损伤，对细胞具有免疫调节活性。

注：不同小写字母表示各处理间的差异在P<0.05水平上具有统计学意义。图5 BPP-21对RAW264.7细胞SOD和MDA的影响Fig.5 Effect of BPP-21 on SOD and MDA levels of RAW264.7 cells

本文主要研究了蜂蛹多肽纯化组分BPP-21对RAW264.7巨噬细胞的免疫活性的影响，表明BPP-21具有较好的免疫调节活性，可为研究与开发蜂蛹多肽免疫调节剂提供理论基础，后续将通过对RAW264.7细胞内细胞因子和iNOS mRNA表达量的影响；对MAPKs信号通路受体蛋白和转录因子表达的影响对其免疫调节机制进行深入研究。