基于低场核磁共振T1-T2谱技术定性和定量分析罗非鱼各组织的方法探究

刘宏亮,丁倩雯,TSEGAY Teame,郝强,王安然,马德铭,冉超,杨雅麟,张震*,周志刚*

1.中国农业科学院饲料研究所水产动物饲料创新团队，北京 100081；2.北京大学信息科学技术学院量子电子学研究所，北京 100871

在水产营养和饲料研究中，选择合适的检测指标对有效地评定营养素的作用和指导配合饲料的生产尤为重要。形体指标的检测是鱼类常规营养评定的重要组成部分，包括含肉率、脏体比、脂体比等。含肉率是衡量鱼类生产性能的重要指标之一，受鱼的种类、生活环境、饵料等影响[1]；脂体比检测具有重要现实意义，由于蛋白质原料的缺乏，水产养殖中高脂饲料的应用越来越普遍，造成鱼体脂肪组织过量蓄积及鱼类营养性疾病频发[2]，其中鱼类脂肪组织主要是指腹腔脂肪组织[3-4]；脏体比能够反映鱼类营养状态。目前，鱼类营养研究中，鱼类含肉率的检测是测定鱼体重后，去除鳃、鳍、骨板、内脏和骨骼等非肉质部分，称量各部分重量，计算出鱼体肌肉占体重的百分比[1]；脂体比的检测是测定鱼体重后解剖取腹腔脂肪组织称重，计算出脂肪组织占体重的百分比[5]；脏体比是解剖鱼体称量内脏，计算出内脏占体重的百分比。可以看出，形体指标的常规测定需要解剖鱼体，会造成样品损失，而且耗时耗力。因此，建立无损快速检测技术来定量分析各组织含量是鱼类营养评定中的重要需求。

低场核磁共振技术具有快速、无损的特点[6]。样品中处于不同能态的氢质子比例符合玻尔兹曼平衡，对样品施加射频脉冲后，低能态氢质子向高能态跃迁，停止脉冲射频后，氢质子回到基态恢复玻尔兹曼平衡，这个过程所需要的时间被称为驰豫时间[7-8]，包括纵向弛豫时间(T1)和横向弛豫时间(T2)[9]。1H低场核磁共振(low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)快速无损检测技术，已被广泛应用于食品、高分子、石油、医药等领域的工业质量控制中，用于测定各种材料的固液比和油水比，如含油岩石、食品乳剂和植物种子等[10]。弛豫时间分布实验包括简单、快速的一维实验以及更为复杂的多维实验。一维实验使用脉冲之间的恒定间隔，允许评估纵向或横向弛豫；而在多维实验中，信号是作为2个或多个自变量的函数测量的，允许自旋系统在不同弛豫机制下演化[11]。常用的一维工具是基于90°脉冲后自由感应衰减信号的采集，如脉冲序列自旋回波、脉冲场梯度自旋回波、自旋回波、反演/饱和恢复[12]。有研究人员提出了新的二维(two-dimension，2D)弛豫时间分布脉冲序列，包括T1-T2[11]、T2-store-T2[13]和T2-D[14]。其中，低场核磁共振T1-T2谱技术已被应用于油菜籽成分分析[12]和岩石含油分析[15]。

近年来，核磁共振分析逐渐被应用于水产相关研究中，如利用低场核磁共振技术分析水产品干燥过程中的水分含量[16]、研究水产品蛋白质变性[17]、预测水产品理化指标[18-19]以及检测水产动物脂肪体积[3-4,20]。由此可知，核磁共振分析主要被应用于水产品加工的相关研究中，在水产动物营养相关研究中的应用较少，而且多是基于一维核磁技术和核磁成像技术，利用低场核磁共振T1-T2二维谱技术对鱼类组织进行定性及定量分析尚未见报道。基于此，本研究以罗非鱼为实验对象，探究利用低场核磁共振T1-T2谱技术对罗非鱼组织进行定性和定量分析的可行性。首先，利用低场核磁共振T1-T2谱技术对罗非鱼的肌肉组织、腹腔脂肪组织、肝脏组织、肠道组织进行定性分析；然后采用组织混合模拟活体，进一步验证各组织信号能否实现分离鉴定；随后对能够实现分离的组织信号建立定量分析的模型，并验证其可靠性，以期推进利用低场核磁共振T1-T2谱技术确定组织含量的快速无损技术在鱼类营养代谢研究中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗非鱼购自北京超市发超市。

SPEC-RE1-3D型核磁共振分析仪(北京斯派克科技发展有限公司)，相关参数为：磁场强度：0.5 T；氢质子共振频率：21 MHz；磁体温度：37 ℃；样品测试区域：20 mm×20 mm(高×直径)圆柱。

1.2 实验方法

1.2.1低场核磁共振T1-T2谱技术检测的一般步骤 将水模标准样置入试管后插入核磁共振探头中，在核磁共振2D(nuclear magnetic resonance 2D，NMR 2D)扫描软件上选择氢火焰离子化检测器(flame ionization detector，FID)脉冲序列，点击频率搜索功能，获取设备氢核共振频率，继续点击脉冲宽度搜索功能，获取90°及180°激励脉冲的宽度。随后，取出水模标准样，将待测样品放入核磁试管并置于核磁共振探头中，在NMR 2D扫描软件中选择T1-T2脉冲序列，设置饱和恢复时间最小值(TIMin)为100 μs，饱和恢复时间最大值(TIMax)为2 000 000 μs，以TIMin至TIMax对数分布31个不同的饱和恢复时间点，检测各饱和恢复时间点的回波串信号。仪器主要测试参数如下：90°脉冲宽度15 μs；180°脉冲宽度30 μs；探头稳定时间10 μs；滤波器稳定时间10 μs；回波间隔300 μs；磁场主频19.42 MHz；滤波器带宽10 000 Hz；采样间隔4 μs；回波采样点数1；采集回波个数4 096；扫描次数8。

数据采集结束后使用T1T2Inv反演软件对采集的信号进行T1-T2二维谱分析，获取被测样品的T1弛豫时间、T2弛豫时间以及T1/T2比值。T1-T2二维谱中横坐标为T2弛豫时间，纵坐标为T1弛豫时间，以不同颜色表示核磁共振信号幅度值(无因次)。

1.2.2罗非鱼扫描检测 ①组织定性：将罗非鱼(2 kg)麻醉后，取罗非鱼的肌肉组织、腹腔脂肪组织、肝脏组织和肠道组织，去除其他组织残留，根据1.2.1中操作步骤分别对肌肉组织、腹腔脂肪组织、肝脏组织、肠道组织进行定性分析；

②定性分离验证：将①中的4种组织混合模拟活体，根据1.2.1中步骤进行操作，验证利用低场核磁T1-T2谱技术分离组织的可靠性；

③组织标准曲线制作：根据②的结果，将可分离组织取梯度重量，进行扫描反演分析，计算各梯度对应信号强度，制作“梯度重量-信号强度”标准曲线；

④活体应用：罗非鱼(初始体重0.6±0.05 g)养殖2周(循环水养殖，每天投喂2次罗非鱼商品饲料，每顿投喂量为初始体重3%)，取罗非鱼全鱼称重后进行扫描反演，分析各组织对应信号强度，根据标准曲线计算组织重量，分析组织重量与鱼体重相关性。

1.2.3数据分析 所有的统计数据均来自至少3次以上的重复实验，使用软件T1T2Inv反演软件对采集的信号进行T1-T2二维谱分析，Microsoft Office Excel 2010进行计算，Graphpad Prism 5.0进行制图。

2 结果与分析

2.1 罗非鱼的肌肉组织、腹腔脂肪组织、肝脏组织、肠道组织的离体定性分析

为了对罗非鱼组织进行低场核磁共振T1-T2谱技术扫描反演定性分析，解剖罗非鱼，取肌肉组织、腹腔脂肪组织、肝脏组织、肠道组织，将4种组织分别放进核磁共振分析仪中利用低场核磁共振T1-T2谱技术扫描并反演成像，通过反演软件计算得到各组织纵向弛豫时间T1分布、横向弛豫时间T2分布以及纵向弛豫时间峰值(峰值表示信号达到最高峰对应的弛豫时间值)与横向弛豫时间峰值比值(T1/T2)，结果见表1。根据4种组织单独扫描反演成像结果(图1)发现，4种组织的纵向弛豫时间T1和横向弛豫时间T2有部分重叠；而肌肉组织T1/T2值为12.06±1.07，腹腔脂肪组织T1/T2值为2.05±0.65，肝脏组织T1/T2值为4.9±0.24和肠道组织T1/T2值为5.3±0.3。由此可知，仅根据4种组织的纵向弛豫时间T1和横向弛豫时间T2不能将罗非鱼肌肉组织、腹腔脂肪、肝脏组织和肠道组织彻底分离，但是根据4种组织的T1/T2值，能够将肌肉组织和腹腔脂肪组织彻底分离；而由于肝脏组织和肠道组织的T1、T2重叠及T1/T2值相近，利用低场核磁共振T1-T2谱技术不能区分罗非鱼肝脏组织和肠道组织。

表1 罗非鱼组织定性分析Table 1 Qualitative analysis of tilapia tissues

注：图中以不同颜色表示核磁共振信号幅度值。图1 利用核磁共振T1-T2谱技术扫描罗非鱼肌肉组织、腹腔脂肪组织、肝脏组织、肠道组织反演图Fig.1 The muscle tissue, abdominal adipose tissue, liver tissue, and intestinal tissue of tilapia were scanned by nuclear magnetic resonance T1-T2 spectroscopy

2.2 各组织混合模拟活体检测二维1H LF-NMR定性可靠性

根据2.1的结果可知，在低场核磁共振T1-T2谱技术扫描下，罗非鱼的肌肉组织、腹腔脂肪组织、肠道组织和肝脏组织具有不同的组织特性。为了进一步验证利用低场核磁共振T1-T2谱技术分离罗非鱼组织的可靠性，解剖罗非鱼(约2 kg)，取肌肉组织、腹腔脂肪组织、肝脏组织和肠道组织，并混合，使用T1-T2联合扫描分析。结果显示，反演图中有3个信号区域，分别为T1/T2=2.6，T1/T2=5，T1/T2=11(图2)。根据表1中4种组织的T1/T2值，T1/T2=2.6区域为腹腔脂肪组织信号区域，T1/T2=5区域为肝脏或者肠道的信号区域，T1/T2=11区域为肌肉组织信号区域。这一结果显示，采用低场核磁共振T1-T2联合扫描能够将肌肉组织和腹腔脂肪组织分离，而肝脏组织和肠道组织信号重叠，无法区分。由上述结果可知，利用低场核磁共振T1-T2谱技术能够在混合组织中准确识别肌肉组织和腹腔脂肪组织。

注：图中以不同颜色表示核磁共振信号幅度值。图2 罗非鱼肌肉组织、腹腔脂肪组织、肝脏组织和肠道组织混合进行T1-T2联合扫描Fig.2 Tilapia muscle tissue, abdominal adipose tissue, liver tissue and intestinal tissue were mixed for T1-T2 combined scanning

2.3 罗非鱼肌肉、腹腔脂肪组织定量标准曲线测定

综合2.1和2.2的结果，利用低场核磁共振T1-T2谱技术可以定性分离罗非鱼的肌肉组织和腹腔脂肪组织。为了分析组织信号强度与组织重量之间是否存在联系，取罗非鱼组织梯度重量(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g)进行T1-T2联合扫描后反演，分析区域信号强度与肌肉组织重量之间的关系，扫描结果显示肌肉区域信号强度与肌肉组织重量线性相关，R2=0.974 3(图3)；取罗非鱼腹腔脂肪组织梯度重量(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g)进行T1-T2联合扫描后反演，扫描结果显示脂肪区域信号强度与脂肪组织重量线性相关，R2=0.965 0(图3)。上述结果说明，利用低场核磁共振T1-T2联合扫描可以定量分析罗非鱼全鱼肌肉组织含量及腹腔内脂肪组织含量。

图3 罗非鱼离体组织扫描组织区域信号大小与组织重量关系图Fig.3 The relationship between signal size and tissue weight of tilapia in vitro tissue scanning

2.4 低场核磁共振T1-T2谱技术分析在罗非鱼全鱼中的实际应用

根据前述结果，低场核磁共振T1-T2谱技术能够在离体条件下对罗非鱼肌肉组织和腹腔脂肪组织进行定性和定量分析。为了验证低场核磁共振T1-T2谱技术在罗非鱼活体中应用的可行性，选取初始体重为(0.6±0.05) g的罗非鱼进行为期2周的养殖实验，养殖实验结束后对罗非鱼称重，并利用低场核磁共振T1-T2技术扫描罗非鱼全鱼并反演成像。扫描结果发现，反演图中出现2个信号区域，一个信号区域T1/T2值为12，另一个信号区域T1/T2值为5(图4)。结合组织定性结果(表1，图1)可知，T1/T2值=12的信号区域为肌肉组织信号区域，T1/T2值=5的信号区域为肝脏组织和肠道组织混合信号区域。从全鱼扫描反演图中没有采集到腹腔脂肪组织信号。全鱼扫描反演结果说明利用低场核磁共振T1-T2技术可以从罗非鱼全鱼中分离肌肉组织，由于肝脏组织和肠道组织T1、T2部分重叠及T1/T2值相近，利用核磁共振T1-T2技术无法分离肝脏组织和肠道组织信号区域。

注：图中以不同颜色表示核磁共振信号幅度值。图4 罗非鱼全鱼T1-T2联合扫描反演成像图Fig.4 Tilapia T1-T2 combined scanning inversion image of whole fish

为了验证组织定量结果的可靠性，利用相关反演软件对肌肉组织信号区域信号强度进行计算，并根据定量相关性曲线计算肌肉组织重量，将计算得到的肌肉组织重量与罗非鱼体重进行相关性分析(图5)。相关性分析结果显示，根据信号强度计算得到罗非鱼肌肉组织重量与罗非鱼体重有较好的相关性(R2=0.806 9)。由此可知，利用低场核磁共振T1-T2技术能够分离罗非鱼全鱼肌肉组织，并对罗非鱼全鱼肌肉组织进行定量分析。

图5 计算所得肌肉组织重量/罗非鱼体重Fig.5 Calculated muscle mass/tilapia weight

3 讨论

核磁共振技术具有快速无损检测的特点，被广泛应用于各研究领域。利用核磁共振技术对肌肉组织和脂肪组织的分析在动物实验中已有报道，如根据组织中氢原子核磁共振特性不同和密度不同，利用核磁共振成像测量小鼠的脂肪量和肌肉量[21]；利用不同组织在恒定磁场中对射频信号的反应不同，结合低场核磁共振技术及最小二乘回归法和主成分回归法，建立脂肪和瘦肉含量预测模型[22]；利用时域核磁共振(time-domain nuclear magnetic resonance，TD-NMR)技术检测小鼠体内脂肪含量，分析小鼠肥瘦比[2-3]；水产动物营养研究中有利用核磁共振成像技术分析检测水产动物脂肪体积相关报道[3-4,20]。但目前利用低场核磁共振T1-T2谱技术定性和定量分析鱼类各组织含量尚未见相关报道。

本研究利用低场核磁共振T1-T2谱技术对罗非鱼的肌肉组织、腹腔脂肪组织、肝脏组织、肠道组织进行了定性分析，并通过混合上述4种组织模拟活体检测进行了验证，表明利用低场核磁共振T1-T2谱技术能够分离肌肉组织和腹腔脂肪组织，但是无法分离肝脏组织和肠道组织。随后对肌肉组织和腹腔脂肪组织进行了定量分析模型建立，发现组织信号大小与组织重量有很好的相关性，其中，肌肉组织相关性R2=0.974 3，腹腔脂肪组织相关性R2=0.965 0。为了验证低场核磁共振T1-T2谱技术在罗非鱼活体中应用的可行性，利用低场核磁共振T1-T2技术扫描罗非鱼全鱼，发现能够采集到肌肉组织、肝脏组织和肠道组织信号，但肝脏组织和肠道组织信号无法分离。对于肌肉组织，利用反演软件计算肌肉组织区域信号强度并跟据定量曲线计算肌肉组织重量，进一步发现计算所得肌肉组织重量与罗非鱼全鱼有一定的相关性(R2=0.806 9)。

本研究在全鱼中没有采集到腹腔脂肪组织信号，可能是因为罗非鱼太小，腹腔脂肪组织量太低，在鱼类养殖生产中利用低场核磁共振T1-T2谱技术测量鱼体脂肪含量具有可行性。脏体比是指鱼类内脏占鱼体比重，脏体比反映鱼类营养和健康状态[24]，虽然低场核磁共振T1-T2技术无法分离肝脏组织和肠道组织，但是可以反映脏体比的大小。与鱼类营养研究中的形体指标检测和体成分分析法相比，低场核磁共振T1-T2谱技术具有快速无损以及可重复、动态检测鱼体组织含量的优势。

本研究在活体检测过程中发现没有采集到腹腔脂肪组织信号，需要进一步验证其应用可行性，包括改变罗非鱼规格、构建增脂模型等。此外，需要进一步使用添加剂改变罗非鱼体内肌肉量，验证检测利用低场核磁共振T1-T2谱技术定量肌肉组织准确性与灵敏性；而且，本研究仅在罗非鱼中进行，在其他鱼类或者动物中的应用也值得探究。