宫颈癌组织miR-769-5p、NUSAP1 mRNA表达变化及其临床意义

杜秀銮，戴欣，赵海峰，郭凌川，顾栋桦

1 南京医科大学附属苏州科技城医院，江苏苏州215153；2 苏州大学附属第一医院

宫颈癌是临床常见的妇科恶性肿瘤之一，是女性主要的恶性肿瘤相关死亡原因之一[1]。早期宫颈癌往往不发生局部浸润和远处转移，治疗效果较好。但宫颈癌早期发现率较低，大部分患者出现明显症状就诊时已进入中晚期，错过了最佳治疗时机[2]。目前，手术切除仍然是宫颈癌最主要的治疗手段，但中晚期患者往往伴有局部浸润和淋巴结转移，预后较差[3]。分子靶向治疗是近年新兴的一种肿瘤治疗手段，能够高度选择性地杀灭肿瘤细胞，安全性和耐受性均较好。但宫颈癌发病的分子机制尚不完全清楚，缺少相应的分子治疗靶点。因此，需要深入探索宫颈癌发生、发展的分子机制，从而寻找其分子治疗靶点，以便更好地指导临床治疗。微小RNA(miRNA)是一类非编码单链小分子RNA，长度为18～22个核苷酸，在真核细胞中普遍存在。miRNA具有多种生物学功能，如沉默mRNA与目标mRNA互补结合进而抑制蛋白质翻译。近年研究发现，miRNA在多种恶性肿瘤组织中异常表达，可参与恶性肿瘤的发生、发展。miR-769-5p是miRNA家族的重要成员，其基因定位于人染色体19q13.32，编码蛋白具有调控细胞增殖、分化的作用。有研究证实，miR-769-5p在多种恶性肿瘤细胞中存在异常表达现象，如非小细胞肺癌、肝细胞癌[4]。核仁纺缍体相关蛋白1(NUSAP1)基因定位于人染色体15q15.1，其编码蛋白能够参与细胞有丝分裂的纺锤体装配[5]。近年研究发现，在非小细胞肺癌细胞中NUSAP1表达上调，过表达NUSAP1能够加速细胞周期G2/M期，从而促进肿瘤细胞增殖，导致肿瘤恶性进展。有研究认为，miR-769-5p可通过负向调控NUSAP1表达参与肿瘤恶性进展[6]。2016年8月—2019年8月，本研究检测了miR-769-5p、NUSAP1 mRNA在宫颈癌组织中的表达，并探讨其表达与患者临床病理特征以及二者之间的关系，旨在寻找宫颈癌潜在的分子治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 临床资料 以同期在南京医科大学附属苏州科技城医院和苏州大学附属第一医院住院的，并经组织病理检查确诊的106例宫颈癌患者为研究对象。纳入标准：①符合宫颈癌诊断标准；②接受宫颈癌根治性切除术；③既往未接受手术、放化疗或免疫治疗等抗肿瘤治疗。排除标准：①合并其他宫颈良恶性疾病者；②合并其他全身感染性疾病者；③合并免疫功能缺陷性疾病者；④合并精神障碍性疾病者。患者年龄33～74(50.4±2.2)岁，其中<50岁55例、≥50岁51例；肿瘤直径：<2.5 cm 58例，≥2.5 cm 48例；病理类型：腺癌26例，鳞癌80例；组织分化程度：低中分化46例，高分化60例；FIGO分期：Ⅰ、Ⅱ期85例，Ⅲ、Ⅳ期21例；有淋巴结转移44例，无淋巴结转移62例。本研究经南京医科大学附属苏州科技城医院和苏州大学附属第一医院伦理委员会审核，患者或其家属知情同意并签属知情同意书。

1.2 miR-769-5p、NUSAP1 mRNA表达检测 采用RT-qPCR法。取宫颈癌组织及其配对的癌旁组织(距肿瘤组织边缘>2 cm并经组织病理检查证实为正常宫颈组织)各约50 mg，TRIzol法提取组织总RNA，然后将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，按PCR扩增试剂盒说明进行PCR扩增。所有引物由北京睿博科技有限公司设计合成。引物序列：miR-769-5p上游引物5′-TTGAATGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAACCCATG-3′、下游引物5′-TGGAGCTGGGTGAGACCTCTGGGTTCTG-3′，内参GAPDH上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′、下游引物3′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-5′；NUSAP1上游引物5′-ACCAGACGAGCACCAAGAAG-3′、下游引物5′-ATTGATGGGCTGCTGCTTCA-3′，内参U6上游引物5′-CCACTAGGCGCTCACTGTTCTC-3′、下游引物5′-ACTCCGACCTTCACCTTCCC-3′。按PCR扩增试剂盒说明配制反应体系。miR-769-5p PCR扩增条件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 45 s共40个循环；NUSAP1 mRNA PCR扩增条件：95 ℃ 4 min，56 ℃ 1 min、72 ℃ 10 s共40个循环。收集各样本阈值循环数(CT)值。以GAPDH或U6为内参，以2-ΔΔCT计算目的基因相对表达量。

2 结果

2.1 不同组织miR-769-5p、NUSAP1 mRNA表达比较 宫颈癌组织miR-769-5p相对表达量低于癌旁正常组织，NUSAP1 mRNA相对表达量高于癌旁正常组织(t分别为68.894、56.959，P均<0.01)。见表1。

表1 宫颈癌组织与癌旁正常组织miR-769-5p和NUSAP1 mRNA相对表达量比较

2.2 宫颈癌组织miR-769-5p、NUSAP1 mRNA表达与患者临床病理特征的关系 见表2。

表2 宫颈癌组织miR-769-5p、NUSAP1 mRNA表达与患者临床病理特征的关系

2.3 NUSAP1 mRNA表达与miR-769-5p表达在宫颈癌组织中的关系 相关分析显示，宫颈癌组织miR-769-5p表达与NUSAP1 mRNA表达呈负相关关系(r=-0.529，P<0.05)。

3 讨论

宫颈癌是女性第二大常见恶性肿瘤，全球每年新增病例超过50万例，死亡约30万例[7]。迄今为止，宫颈癌发病的确切分子机制尚不完全清楚。目前，手术切除仍是宫颈癌首选的治疗手段，尤其是宫颈癌早期，手术治疗效果较好，5年生存率较高[8]。但宫颈癌早期症状不典型，部分患者就诊时已出现盆腔淋巴结转移，单纯手术治疗效果较差，需要联合放化疗或分子靶向治疗等。因此，进一步研究与宫颈癌发病相关的分子，才能更好地指导临床防治。

miRNA是一类非编码单链小分子RNA，长度为18～22个核苷酸，可与靶基因mRNA的3′非翻译区结合，从而调控基因的表达[9]。近年研究发现，在恶性肿瘤细胞中存在多种miRNA使特定的基因激活或失活，或通过分子支架结合细胞内其他分子，影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等，从而影响肿瘤的发生、发展[10-11]。miR-769-5p是miRNA家族成员之一，其基因定位于人染色体19q13.32。有研究发现，miR-769-5p可作为一种抑癌基因，在恶性肿瘤的发生、发展过程中发挥重要的生物学调控作用。有研究报道，miR-769-5p可通过靶向抑制转化生长因子受体1表达，抑制肺癌细胞的增殖和迁移[12]。但miR-769-5p在宫颈癌中的作用机制尚不完全清楚。本研究发现，在宫颈癌组织中miR-769-5p低表达，并且其表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、FIGO分期密切相关，提示miR-769-5p可能参与宫颈癌的发生、发展。有研究表明，miR-769-5p过表达不仅能诱导肿瘤细胞凋亡，还能抑制肿瘤细胞增殖、迁移以及上皮间质转化等，从而实现抑制肿瘤生长的作用[13]。肿瘤组织miR-769-5p表达降低能够促进肿瘤细胞生长、增殖和迁移等，从而促进肿瘤恶性进展。CHEN等[6]研究证实，miR-769-5p在恶性肿瘤的发生、发展过程中可能起抑癌基因作用；miR-769-5p可下调转化生长因子β1表达，通过抑制癌基因c-Myc表达，抑制膀胱癌细胞DNA的复制和转录并诱导其凋亡，从而抑制肿瘤恶性进展。

NUSAP1基因定位于人染色体15q15.1，其编码蛋白属于核仁纺锤体相关蛋白家族成员之一。NUSAP1是2003年首次发现的一种微管结合蛋白，其相对分子质量约为5.5 kD，通常定位于核仁中[14]。在功能上，NUSAP1可促进微管聚集、纺锤体和染色体连接，并维持血管束的稳定性[15]。NUSAP1在增殖细胞中表达丰富，而在不可再生组织细胞中几乎不表达。有研究报道，NUSAP1表达上调能够加速正常细胞增殖，并促进增殖细胞的有丝分裂。近年研究发现，NUSAP1在多种恶性肿瘤细胞中过表达，如胰腺癌、黑素瘤、白血病等，且其过表达通常与恶性肿瘤细胞的侵袭性增强有关[16]。但目前NUSAP1在宫颈癌中的作用机制研究较少。本研究发现，在宫颈癌组织中NUSAP1 mRNA高表达，提示NUSAP1在宫颈癌的发生、发展中具有一定作用。NUSAP1表达上调能够激活宫颈癌细胞中BTG2/PI3K/AKT信号通路，促进PI3K、p-AKT表达，增强肿瘤细胞的增殖和迁移能力[16]。有研究报道，NUSAP1高表达可促进TGF-β1信号转导通路中关键的激活因子FAM101B表达，FAM101B能够促进宫颈癌细胞上皮间质转化，从而促进肿瘤恶性进展[17]。

本研究还发现，在宫颈癌组织中miR-769-5p表达与NUSAP1 mRNA表达呈负相关关系。目前，二者在宫颈癌中确切的相互作用机制尚不清楚。CHEN等[6]研究发现，miR-769-5p通过与NUSAP1的受体结合区域结合，从而抑制NUSAP1表达，继而促进膀胱癌细胞增殖。此外，NUSAP1可能亦受miR-769-5p的转录后表达调控，当miR-769-5p表达降低时，其对NUSAP1的抑制作用减弱，而NUSAP1表达升高则可促进肿瘤细胞恶性增殖。但在宫颈癌中miR-769-5p与NUSAP1具体的相互作用机制仍需深入研究。

综上所述，宫颈癌组织miR-769-5p低表达，NUSAP1 mRNA高表达，二者表达呈负相关关系，并与肿瘤组织分化程度、FIGO分期、淋巴结转移有关。但二者在宫颈癌发生、发展过程中具体的作用机制还需要大样本、多中心的随机对照研究进一步证实。