Eplet匹配对肾移植术后供者特异性抗体产生及急性排斥反应发生的影响

匡培丹，张璇，张颖，丁小明，薛武军，雷艳君，郑瑾

西安交通大学第一附属医院，西安710061

肾移植是终末期肾病的一种有效治疗手段，但肾移植术后供者特异性抗体(DSA)产生和急性排斥反应发生可导致移植肾失功能。因此，移植肾长期存活仍然是目前移植领域亟待解决的问题之一[1-2]。组织配型技术的快速发展，使器官移植供受者选择达到了更为精准的层面。近年来，在肾移植领域涌现出了大量关于人类白细胞抗原(HLA)功能性表位(Eplet)的报道[3-4]。研究发现，HLA匹配程度与肾移植长期存活密切相关[5]。良好的HLA匹配，不仅可减少肾移植患者免疫抑制剂应用剂量，还可降低患者致敏程度[6]。目前，临床器官移植主要的HLA匹配方式有HLA抗原匹配、氨基酸残基(Res M)匹配和HLA Matchmaker匹配。HLA抗原匹配和Res M匹配仅需要HLA血清学分型结果，方法相对简单，易操作。然而，就单个移植中心而言，由于供受者样本池太小，获得良好供受者HLA抗原匹配的概率非常低。Res M匹配基于交叉反应组[7]，能够提高供受者良好的匹配概率，但对于致敏受者预存的供者DSA无法有效避开。HLA Matchmaker匹配基于HLA抗原氨基酸序列上的Eplet，需要分析供受者HLA基因分型，方法较为复杂，耗费时间较长。Eplet匹配将HLA抗原描述为一系列抗体靶点或表位，相对于HLA抗原匹配或Res M匹配，能够提供一个更结合临床实际的HLA匹配系统，从而降低了移植后致敏的风险，避免了移植术后急性排斥反应的发生[8]。但目前国内关于肾移植Eplet匹配的研究报道较少。本研究探讨了Eplet匹配对肾移植术后DSA产生及急性排斥反应发生的影响，旨在揭示Eplet匹配在肾移植组织配型中的应用价值。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年1月—2018年6月在西安交通大学第一附属医院实施肾移植术患者787例。纳入标准：①首次接受肾移植术；②年龄18～65岁；③术前群体反应性抗体(PRA)阴性；④术后接受免疫抑制剂治疗；⑤临床病理资料和随访资料完整。排除标准：①合并急慢性感染性疾病者；②合并心、肝、肺等重要脏器严重疾病者；③合并恶性肿瘤者；④术后出现急性排斥反应者；⑤治疗依从性差者。根据供者来源分为公民逝世后捐献即死亡捐献(DD)632例和亲属活体捐献(LRD)155例。DD受者男455例、女177例，年龄(36.05±9.01)岁，BMI(20.40±2.95)kg/m2，透析龄(13.01±7.20)个月，原发病：慢性肾炎362例、IgA肾病91例、膜性肾病81例、高血压肾病67例、其他31例；LRD受者男127例、女28例，年龄(26.13±6.01)岁，BMI(21.60±1.97)kg/m2，透析龄(9.13±3.51)个月，原发病：慢性肾炎92例、IgA肾病21例、膜性肾病18例、高血压肾病16例、其他8例。DD供者男508例、女124例，年龄(44.98±11.36)岁，BMI(21.80±2.43)kg/m2，原发病：脑外伤296例、脑出血294例、脑胶质瘤24例、其他18例；器官获取前血清Scr(107.86±80.34)μmol/L，热缺血时间(4.58±1.67)min，冷缺血时间(8.74±3.58)h；LRD供者男76例、女79例，年龄(46.45±4.36)岁，BMI(22.7±3.05)kg/m2，器官获取前血清Scr(69.38±10.52)μmol/L，热缺血时间(2.13±0.57)min，冷缺血时间(1.14±0.34)h。DD受者与LRD受者年龄、透析龄比较P均<0.05，其余临床资料比较P均>0.05；DD供者与LRD供者性别、血清Scr水平、热缺血时间、冷缺血时间比较P均<0.05，年龄、BMI比较P均>0.05。本研究符合医学伦理学标准，并经西安交通大学第一附属医院人体器官移植临床伦理委员会批准。研究对象或其家属知情同意并签属知情同意书。

1.2 研究方法 肾移植前采用LABType SSO HD试剂盒对供受者HLA Ⅰ类(A、B、C位点)和Ⅱ类(DR、DQ位点)抗原进行高分辨分型，采用LABType SSO试剂盒进行中分辨分型，经Fusion软件分析获取供受者HLA抗原基因分型和血清学分型信息。

供受者在肾移植手术前进行HLA抗原匹配和Res M匹配。HLA抗原匹配根据供受者实际HLA抗原血清学分型的位点进行人工对比匹配，供受者HLA抗原位点完全相同视为匹配，否则视为不匹配；Res M匹配根据供受者HLA抗原血清学分型位点所在的CREA进行匹配[7]，如供受者HLA抗原在同一CREA视为匹配，否则视为不匹配。Eplet匹配根据供受者HLA抗原基因分型位点，采用HLA Matchmaker软件(Version 2.1，available from: www.hlamatchmaker.net)进行供受者Eplet匹配错配数分析，如供受者HLA抗原氨基酸序列上的Eplet相同视为匹配，否则视为不匹配。

1.3 肾移植术后免疫抑制治疗与随访 肾移植手术期间和肾移植术后1～4 d予抗人胸腺细胞球蛋白50 mg/d、甲基强的松龙250 mg/d诱导治疗。肾移植术后接受三联免疫抑制方案治疗：他克莫司0.1 mg/(kg·d)或环孢霉素4.5～5.0 mg/(kg·d)，甲基强的松龙10～20 mg/d；肾移植术后第1天吗替麦考酚酯1.5～2.0 g/d。环孢霉素或他克莫司与甲基强的松龙在诱导治疗最后1 d同步给药。

肾移植术后门诊定期随访，分别于第4、12、26、52周，留取血清样本，采用LABScreen Mix试剂盒检测PRA。如果PRA阳性，采用LABScreen Single Antigen试剂盒进一步检测HLA Ⅰ、Ⅱ类DSA，并评估样品中每个微珠的平均荧光强度(MFI)。MFI峰值≥1 000为阳性。

1.4 急性排斥反应判断 急性排斥反应的临床诊断根据《肾移植排斥反应临床诊疗技术规范(2019版)》[9]。移植肾组织抗体介导的排斥反应(AMR)、细胞介导的排斥反应(TCMR)、AMR+TCMR病理诊断依据《Banff-2017移植肾病理分类方案》。

2 结果

2.1 供受者Eplet匹配错配数与HLA Res M匹配、HLA抗原匹配错配数的关系 供受者HLA A、B、C、DR、DQ位点Eplet匹配错配数为62.18±21.62，HLA A、B、DR位点Eplet匹配错配数为50.59±17.00。供受者HLA A、B、DR位点Res M匹配错配数为1.84±1.00，A、B、C、DR、DQ位点HLA抗原匹配错配数为8.05±1.58。Pearson相关分析显示，供受者HLA A、B、DR位点Eplet匹配错配数与Res M匹配错配数呈正相关关系(r=0.226，P<0.01)，供受者HLA A、B、C、DR、DQ位点Eplet匹配错配数与HLA抗原匹配错配数亦呈正相关关系(r=0.475，P<0.01)。

2.2 LRD与DD供受者HLA匹配效果比较 LRD与DD供受者Eplet匹配错配数分别为43.94±19.86、66.65±19.60，二者比较P<0.01。见表1。

表1 LRD与DD供受者HLA匹配效果比较

2.3 LRD与DD移植术后HLA抗体产生和急性排斥反应发生情况比较 LRD受者肾移植术后PRA阳性率为5.16%(8/155)、DSA阳性率为1.29%(2/155)，DD受者肾移植术后PRA阳性率为12.50%(79/632)、DSA阳性率为3.48%(22/632)，LRD受者肾移植术后PRA、DSA阳性率均低于DD受者(P均<0.01)。LRD受者肾移植术后急性排斥反应的发生率为3.23%(5/155)，DD受者肾移植术后急性排斥反应的发生率为9.65%(61/632)，DD受者肾移植术后急性排斥反应的发生率高于LDR受者(P<0.01)。

2.4 Eplet匹配错配数与肾移植术后HLA抗体产生的关系 PRA阳性与阴性受者Res M匹配错配数分别为2.11±1.13、1.80±0.41，二者比较P<0.05；DSA阳性与阴性受者Res M匹配错配数分别为2.08±1.14、1.81±0.45，二者比较P<0.05。PRA阳性与阴性受者HLA抗原匹配错配数分别为8.04±1.73、8.05±1.82，二者比较P>0.05；DSA阳性与阴性受者HLA抗原匹配错配数分别为8.09±1.09、8.03±1.54，二者比较P>0.05。PRA阳性与阴性受者Eplet匹配错配数分别为72.12±21.73、61.08±21.34，二者比较P<0.05；DSA阳性与阴性受者Eplet匹配错配数分别为73.00±20.42、61.97±21.59，二者比较P<0.05。

2.5 Eplet匹配错配数与肾移植术后急性排斥反应发生的关系 787例接受肾移植患者术后急性排斥反应的发生率为8.39%(66/787)，其中AMR为3.05%(24/787)、TCMR为3.94%(31/787)、AMR+TCMR为1.40%(11/787)。急性排斥反应阳性与阴性受者Res M匹配错配数分别为1.87±0.82、1.84±1.01，HLA抗原匹配错配数分别为8.36±1.19、8.04±1.59，二者比较P均>0.05。急性排斥反应阳性与阴性受者Eplet匹配错配数分别为72.17±21.04、61.58±21.48，二者比较P<0.05。

2.6 Eplet匹配错配数对肾移植术后DSA产生和急性排斥反应发生的预测效能 HLA抗原匹配错配数预测肾移植术后DSA产生的曲线下面积(AUC)为0.673(95%CI：0.527～0.775，P<0.05)，其截断(cut off)值为8.50，此时其预测肾移植术后DSA产生的敏感度为71%、特异度为55%；Res M匹配错配数预测肾移植术后DSA产生的AUC为0.613(95%CI：0.505～0.720，P>0.05)；Eplet匹配错配数预测肾移植术后DSA产生的AUC为0.719(95%CI：0.621～0.817，P<0.05)，其cut off值为78.59，此时其预测肾移植术后DSA产生的敏感度为71%、特异度为79%。

HLA抗原匹配错配数预测肾移植术后急性排斥反应发生的AUC为0.612(95%CI：0.522～0.701，P<0.05)，其cut off值为8.50，此时其预测肾移植术后急性排斥反应发生的敏感度为68%、特异度为57%；Res M匹配错配数预测肾移植术后急性排斥反应发生的AUC为0.502(95%CI：0.414～0.590，P>0.05)；Eplet匹配错配数预测肾移植术后急性排斥反应发生的AUC为0.737(95%CI：0.646～0.828，P<0.05)，其cut off值为75.43，此时其预测肾移植术后急性排斥反应发生的敏感度为70%、特异度为78%。

3 讨论

肾移植是目前终末期肾病最佳的替代治疗方法，但肾移植术后受者DSA产生和急性排斥反应发生可导致移植肾失功能。目前认为，DSA产生和急性排斥反应发生的原因包括HLA不完全匹配、免疫抑制剂治疗剂量不足、移植肾功能延迟恢复等，其中HLA不完全匹配是DSA产生和急性排斥反应发生的直接原因。

HLA是宿主免疫系统识别的主要组织相容性抗原。以往研究认为，HLA Ⅰ类抗原不匹配是LRD肾移植临床效果不佳的预测因子，但在DD肾移植中并不重要[5]。随着HLA DR位点的发现，HLA抗原不匹配对DD肾移植的影响得到了证实[10]。即使是在钙调神经抑制剂的免疫抑制疗法时代，HLA A、B、DR位点匹配情况与移植物存活率仍存在明显的线性关系[11]。体液免疫被认为是导致慢性同种异体移植物丢失的最主要原因[12]。HLA抗原不匹配是新生HLA特异性抗体产生的危险因素，同时又与较差的移植物存活率及移植术后致敏作用增强密切相关[13]。因此，良好的供受者HLA匹配是组织器官移植的基础。1987年美国器官分配联合网制定了强制性HLA六抗原匹配肾脏分享政策，要求ABO血型相容和HLA六个抗原相配的肾脏在全国范围内共享。按零抗原错配标准选择供受者的肾移植能够获得较为理想的1、5、10、20年肾存活率，但能够达到六抗原相配的肾移植仅占2%～5%。由于我国各移植中心供受者的样本池太小，能够达到零抗原错配标准的肾移植比例更低。因此，HLA抗原错配标准的临床实用性受到很大限制。1996年，TAKEMOTO研究团队对近4万例尸体肾移植进行随访分析，提出了一种新的配型策略——Res M匹配，又称交叉反应组配型[7]。目前，我国多数器官移植中心认同HLA Ⅰ、Ⅱ类Res M配型标准[14]。但由于Res M配型标准基于HLA抗原血清学分型交叉反应组，对致敏受者体内预存的DSA无法有效避开。

抗原表位是结合DSA所需的最小结构决定因素。抗体的抗原结合位点是由轻链和重链的可变区域配对形成的。近年研究发现，抗原抗体结合的特异性主要是由2～5个氨基酸组成的集群决定，称之为Eplet[15]。DUQUESNOY团队基于HLA Matchmaker软件(www.epitopes.net)分析供者所含有的非受者自身Eplet个数发现，Eplet个数能够预测移植术后DSA产生的概率，并且其预测DSA产生概率的准确性明显优于HLA抗原匹配错配数和Res M匹配错配数[15-17]。

本研究结果显示，供受者Eplet匹配错配数与传统组织配型方法HLA抗原匹配错配数、Res M匹配错配数均密切相关；LRD供受者各位点Eplet匹配错配数均低于DD供受者各位点Eplet匹配错配数，与LIM等[8]报道基本一致。本研究结果还发现，肾移植术后PRA、DSA阳性受者Eplet匹配错配数均高于其阴性受者；同样，肾移植术后发生急性排斥反应受者Eplet匹配错配数高于未发生急性排斥反应受者。虽然Res M匹配错配数在肾移植术后PRA、DSA阳性受者与PRA、DSA阴性受者存在统计学差异，但是其在发生急性排斥反应受者与未发生急性排斥反应受者之间并无统计学差异，而HLA抗原匹配错配数在肾移植术后PRA阳性与阴性、DSA阳性与阴性以及发生与未发生急性排斥反应受者之间均无统计学差异。但在相同条件下，基于Eplet匹配错配数的分析结果却能与DSA产生和急性排斥反应发生有关，并且Eplet匹配错配数对肾移植术后DSA产生及急性排斥反应发生的预测价值明显优于HLA抗原匹配错配数和Res M匹配错配数。结果表明Eplet匹配错配数与HLA抗原匹配错配数、Res M匹配错配数具有一定关系，并且较传统组织配型方法更灵敏。但Eplet匹配的临床应用还有一些问题亟待解决。首先，高分辨率的HLA分型是确定HLA抗原表位的必要条件。其次，需要一个能定义完整Eplet表位的健全系统。虽然DUQUESNOY团队的Eplet是最佳的候选产品，但所有Eplet的生物学相关性和相对免疫原性还有待进一步确定。

综上所述，供受者Eplet匹配错配数与HLA抗原匹配错配数和Res M匹配错配数密切相关，并可影响肾移植受者术后DSA产生和急性排斥反应发生。Eplet匹配较传统组织配型方法更灵敏，具有更广泛的临床应用前景。