蛹草拟青霉FY1421培养物对南美白对虾生长性能、血液生化指标和免疫功能的影响

刘晓红，黄钦耿，梁 玲，赵 颖，唐谢芳，蒋顺进，黄炜乾，吴松刚

(1.辽东学院农学院， 辽宁 丹东 118003；2.广东容大生物股份有限公司， 广东 清远 511500；3.福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心， 福建 福州 350107)

饲用抗生素在动物促生长、提高饲料报酬等方面具有显著的效果[1]。但随着抗生素作为动物促生长剂在饲料中的广泛使用，其弊端正日益凸现，如导致动物胃肠道菌群失调、免疫刺激、广泛耐药性和药物残留等，也引发了一系列公共安全、环境保护和食品安全方面的问题[2-3]。2020年，中国正式进入“无抗养殖”新时代，饲料端全面禁抗，饲用抗生素替代品研究受到广泛关注，如何开发寻找无毒、高效、不产生耐药性的绿色安全饲料添加剂已成为动物营养领域热点之一。

蛹虫草在中国、韩国和日本已长期用作营养和保健食品，具有多种重要的生理活性[4]。蛹虫草作为一种广为人知的药食用真菌之一，在分类学上隶属于真菌界Fungi、子囊菌门Ascomycota、粪壳菌纲Sordariomycetes、肉座菌亚纲Hypocreomycetidae、肉座菌目Hypocreales、虫草科Cordycipitaceae、虫草属Cordyceps[5]。目前，蛹虫草已经进入我国新资源食品和新食品原料目录，是国家认定的健康食品来源，其无性型菌株-蛹草拟青霉作为寄生于鳞翅目昆虫蛹体的昆虫病原菌，正是其广泛的药理活性成分的主要来源[6]。虫草素作为蛹虫草的标志性活性成分，国内外研究都显示其具有非常好的抗病毒、炎症修复以及免疫调节的功能[7]。此外，蛹草拟青霉代谢产生的其他活性物质，如虫草多糖、虫草酸、腺苷、甾醇类、超氧化物歧化酶(SOD)等，也展现非常广泛的生理与药理功能。Koh等[8]发现虫草菌丝体的热水浸提物用作抗生素生长促进剂替代品，能够提高肉鸡生长性能和免疫机能，改善动物肠道微生物组成；Han等[9]研究结果显示，添加1 g·kg-1蛹草菌丝体及其代谢产物(虫草素含量约为5.09 mg·g-1)显著增加肉仔鸡日增重，对肉仔鸡的生长性能具有积极影响；Cheng等[10]在断奶仔猪中添加1 000 μg·kg-1的虫草素含量约为5.0 mg·g-1的蛹草拟青霉菌丝体及其代谢产物，可促进仔猪的生长性能和细胞介导的免疫力，有助于降低仔猪断奶生理和免疫应激。不仅仅菌丝体，Waewagee等[11]采用蛹虫草培育的基座(虫草素含量约为3.63 mg·kg-1)，在育肥猪日粮中添加2.0 g·kg-1的蛹虫草培养基座可显著提高猪的生长性能，增强其免疫球蛋白分泌和抗氧化能力，同时降低生长猪的白细胞百分比，胆固醇和丙二醛浓度，而不损害肝功能。

因此，蛹草拟青霉及其代谢产物作为功能性饲料添加剂，被证明是动物生产中有效的营养调节素，能够有效增强细胞活力，帮助机体建立免疫防线，从而提高免疫力，不仅可以改善动物健康，还可以减少药物使用，改善肠道生态。本研究正是基于蛹虫草丰富的生理和药理功能，以特异型高产虫草素蛹草拟青霉菌株FY1421(paecilomycesmilitarisFY1421)为基础，通过发酵获得富含虫草活性成分的蛹草拟青霉培养物，评估其作为饲料添加剂对南美白对虾生长性能及免疫能力的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蛹草拟青霉FY1421(paecilomycesmilitarisFY1421)菌种由辽东学院虫草研究所提供，保藏编号为CCTCC NO：M2016220。南美白对虾由福清宏峰泰水产养殖公司提供。南美白对虾0、1号饲料由福建大昌生物科技实业有限公司提供。其中0号饲料为对虾幼虾饲料：秘鲁鱼粉37%、白鱼粉18%、乌贼膏4%、大豆磷脂6%、发酵豆粕14%、虾肉粉7%、海藻粉2.5%、次粉6.5%、小麦面筋粉5.2%、食盐0.4%、预混料4%；1号饲料为对虾中成虾饲料：智利鱼粉30%、国产鱼粉8%、乌贼膏4%、发酵豆粕18%、花生粕6%、虾壳粉10%、大豆磷脂5%、小麦粉10.5%、鱼油1.5%、磷酸二氢钙2.6%、乳酸钙0.4%、预混料4%。

1.2 蛹草拟青霉FY1421培养物的制备

将活化后的蛹草拟青霉菌块接种到装有150 mL马铃薯葡萄糖蛋白胨液体培养基(配方：马铃薯的浸汁200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、蛋白胨3 g·L-1)的20瓶三角瓶(250 mL)中，然后将其放置摇床振荡培养，转速为230 r·min-1、28℃恒温培养5 d，制成种子液3 L。将3 L蛹草拟青霉种子液接种到50 L发酵罐，发酵罐装30 L马铃薯葡萄糖蛋白胨培养基(配方：马铃薯的浸汁200 g·L-1、葡萄糖30 g·L-1、蛋白胨5 g·L-1)，28℃，通气量10～15 L·min-1，压力0.1 MPa下发酵培养3 d。发酵结束后，加入0.25%(w/v)的轻质碳酸钙，进风135℃，出风85℃进行低温喷雾干燥，得到蛹草拟青霉FY1421培养物。参考(NY/T 2116-2012《虫草制品中虫草素和腺苷的测定高效液相色谱法》)方法检测其虫草素含量，获得的FY1421培养物虫草素含量为5.2 g·kg-1。

1.3 试验分组以及饲养管理

首先进行对虾幼苗培育，将幼虾苗投放于5 m×3 m×1.5 m的水池中培养，水的盐度为6‰，24 h充气，水温在24～29℃，初始只投放0号饲料，投饵量为虾苗总重量的10%，分上下午投喂，每日投饵量增加10%。投喂20 d后，开始选择健康、大小均匀的南美白对虾，进行1号饲料喂养试验。喂养试验采用循环水机(福建省宁德市金鼎海洋水产研究所，GBL-800YZ-200型)，设试验组与对照组，每组3个平行，每组各投放100尾，饲养于120 cm×80 cm×60 cm的圆形水族箱。试验组以0.05%添加蛹草拟青霉FY1421培养物，添加剂加水与饲料充分混匀，对照组只投喂基础饲料。投饵量为该水箱内虾苗总重量的10%，分上下午投喂，每日投饵量增加10%。每日中午利用循环水泵吸出池底的残饵和粪便，每周对水箱内添加新鲜的0.6%海水，试验期间水盐度保持于0.4%～0.7%，水温为23～30℃，24 h充气，饲养30 d后，测定相关指标。

1.4 南美白对虾生长指标的测定

试验开始测量每组虾的总重量，结束时分别测量每尾虾的体重，同样测量每组虾的初始长度，结束时分别测量每尾虾的长度，去头剥壳取肌肉。按以下公式分别计算增重率、增长率、成活率、出肉率和饲料系数：

增重率=(末体重-初始体重)/初始体重×100%；

增长率=(末长度-初始长度)/初始长度×100%；

成活率=末尾数/初始尾数×100%；

出肉率=肌肉重/末体重×100%；

饵料系数=(末体重-初体重)/总喂食的饲料量×100%。

1.5 南美白对虾免疫指标的测定

首先用10 mL的注射器从对虾背部的围心腔中吸取血液，注入到1.5 mL离心管中，冰浴，4℃，12 000 r·min-1，10 min，取上清即为蓝色的对虾血清，-80℃冷冻保存备用。分别测定血清中溶菌酶、酚氧化酶。

溶菌酶活力的测定：用0.1 mol·L-1，pH=6.4的磷酸钾盐缓冲液溶解溶壁微球菌(Micrococcuslysoleiklicus)的冻干菌粉，将其配制成OD570nm约为0.3的悬液。取0.6 mL事先冰浴好的该悬液，加入10 L血清混匀，马上测量其吸光值，此时为A0，然后将混匀液放入37℃水浴30 min，取出后立即置于冰浴中10 min终止反应，此时测量其吸光值为A末，溶菌酶活力UL按以下公式计算：UL=(A0-A末)/A末。

酚氧化酶活力的测定：以左旋多巴为底物，将1 mL的0.1 mol·L-1、pH=6.0的磷酸钾盐缓冲液与30 L的0.01 mol·L-1左旋多巴以及30 L的血清在室温下混匀后，用酶标仪，每间隔2 min读取在490 nm的吸光值，读取1 h，以试验条件下每分钟增加0.001定义为一个酶活力单位。

肝胰腺中的碱性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活力测定采用南京建成生物工程研究所测定试剂盒。

1.6 南美白对虾抗氧化指标的测定

肝胰腺中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)的测定采用南京建成生物工程研究所测定试剂盒。采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定肌肉中的丙二醛(MDA)，具体参照南京建成生物工程研究所测定试剂盒。

2 结果与分析

2.1 蛹草拟青霉培养物对南美白对虾生长指标的影响

南美白对虾的增重率、增长率、出肉率、成活率、饵料系数见表1。经单因素方差分析(SPSS 18.0)，结果显示，添加0.05%虫草素含量5.1 g·kg-1的蛹草拟青霉FY1421培养物作为饲料添加剂能够有效改善南美白对虾的生长性能。与对照组相比，试验组的增重率提高34.0%，差异显著(P<0.05)，增长率和出肉率也有改善的趋势(P>0.05)。值得关注的是，添加0.05%的蛹虫草拟青霉还能够显著提高个体成活率(成活率提高24.8%，P<0.05)，减少饲料投入(饵料系数降低9.8%)。

表1 南美白对虾的生长指标

2.2 蛹草拟青霉培养物对南美白对虾免疫指标的影响

蛹草拟青霉培养物作为添加剂对南美白对虾血清中的溶菌酶、酚氧化酶活力，肝胰腺中的碱性、酸性磷酸酶活力的影响见表2。

溶菌酶、酚氧化酶、碱性及酸性磷酸酶都是甲壳动物重要的非特异性免疫酶类，也是其天然免疫的重要组成部分，在病原的防御与清除中发挥着重要作用，其活力水平一定程度上也反映了机体免疫功能的强弱。由表2可见，试验组对虾血清中的酚氧化酶、肝胰腺中碱性磷酸酶活力均显著高于对照组(P<0.05)，分别提高34.0%和19.8%。溶菌酶活力和酸性磷酸酶活力也较对照组有改善，但差异不显著(P>0.05)。体现了蛹草拟青霉培养物的添加能够有效改善和促进磷酸酶活性，加速血液中磷酸基团的转移和代谢，提高血液的解毒能力，同时能够基于改善酚氧化酶和溶菌酶的活力增强对虾的防疫与识别体系，提高免疫力。

表2 南美白对虾的免疫指标

2.3 蛹草拟青霉培养物对南美白对虾抗氧化指标的影响

肝胰腺中的超氧化物歧化酶以及过氧化物酶、过氧化氢酶的测定结果见表3。经单因素方差分析，结果显示，添加蛹草拟青霉培养物的试验组超氧化物歧化酶和过氧化物酶活力显著高于对照组(P<0.05)，其中超氧化物歧化酶的活力极显著高于对照组(P<0.01)，体现了较好的肝胰腺细胞的抗氧化活性；试验组过氧化氢酶活力虽较对照组有改善，但差异并不显著。另外，丙二醛作为组织细胞脂质自由基的降解产物，其含量间接反映组织细胞的过氧化程度，蛹草拟青霉培养物的添加明显降低丙二醛含量(P<0.05)，展现了较好抗氧化机能，提高了对虾的生长质量。

表3 南美白对虾的抗氧化能力

3 结论与讨论

自抗生素被发现有利于畜禽的生长发育，其为实现畜牧业快速发展做出了巨大贡献[12]。养殖业一直采用抗生素作为生长促进剂来预防肠道疾病，但长期高剂量、多品种的添加造成耐药菌株产生、药品残留、生态污染等问题[13]，也引发了系列的社会问题。2020年7月1日，中国正式禁止各类促生长抗生素在饲料中的添加，“无抗饲料”正式落地。2020年恰逢饲料禁抗元年，抗生素替代品的研发及应用案列也层出不穷，效果不一。鉴于饲用促生长抗生素的主要作用对象为微生物，作用场所也主要在动物肠道，所以饲用抗生素替代品的研发策略方面，动物肠道健康最受关注，通过维护肠道微生态平衡和提高肠道免疫来促进动物生长和保障动物肠道健康已经成为“后抗生素时代”健康养殖的行业共识。而通过活性营养调节素的形式增强动物免疫力，维护肠道免疫系统正常，允许动物自然防御疾病，使动物机体从根本上对病原形成强有力的抵抗，这无疑是健康养殖的核心。

蛹草拟青霉作为蛹虫草的无性型，其菌体及代谢产物具备蛹虫草子实体一致的虫草活性成分，甚至某些成分含量能够通过发酵控制而高效积累。研究表明，虫草活性成分具有显著地提高巨噬细胞的吞噬能力，激活非特异性免疫，抑菌、抗病毒、抗氧化等功能[14-16]，含有虫草活性物质的饲料添加剂应用于动物饲料中，能够提高饲料利用效率和生产性能，增强动物免疫功能和改善动物产品品质[17]。本研究以南美白对虾为研究对象，通过制备富含虫草素的蛹草拟青霉FY1421培养物，并以此作为饲料添加剂考察其对对虾生长的影响。结果显示，与对照组相比，添加0.05%蛹草拟青霉培养物能够有效改善南美白对虾的生长性能，增重较多(P<0.05)，而且个体成活率较对照组显著改善(P<0.05)，饵料系数也降低了9.8%。其生长性能的改善不仅体现在个体数据上，在血液免疫指标方面，包括溶菌酶、酚氧化酶、碱性磷酸酶都有显著增高(P<0.05)，酸性磷酸酶也有改善(P>0.05)，说明蛹草拟青霉培养物能激活南美白对虾的免疫系统，改善对虾的健康状况。另外，抗氧化指标，包括肝胰腺中的超氧化物歧化酶和过氧化物酶均显著高于对照组(P<0.05)，其中超氧化物歧化酶的活力较对照达到极显著水平(P<0.01)，过氧化氢酶活性虽差异不显著，但其活性也得到明显改善。在过氧化代谢产物丙二醛的含量方面，试验组也较对照组显著降低，间接印证了蛹草拟青霉培养物突出的抗氧化活性。整体而言，蛹草拟青霉培养物可用于改善南美白对虾的生长性能和健康状况，也展示了将具有特殊虫草活性营养调节素的蛹草拟青霉代谢产物作为对虾饲料添加剂，可极大提高对虾的生长指标，增强对虾免疫和抗氧化能力，提高对虾生存和抗病能力，为禁抗后的健康养殖提供了新选择，也为虫草属真菌资源的利用提供新方向。