外泌体中miRNAs 调控骨肉瘤细胞转移的分子机制研究进展*

李耀玺 段莉 王继锋 王大平*

[关键字] 骨肉瘤；miRNAs；外泌体

骨肉瘤作为主要影响儿童和青少年的恶性骨肿瘤，其治疗一直是临床中的难点。三十多年来，骨肉瘤治疗方法主要为手术联合新辅助化疗，而骨肉瘤一旦发生转移，特别是肺转移，其远期生存率不足30%[1]，因此抑制骨肉瘤转移是降低骨肉瘤患者死亡率的重点。近年来，关于外泌体的研究日益增多，外泌体因其所含的丰富的生物活性物质，为人们调节肿瘤的增殖及转移带来新的希望。根据ExoCarta 数据库显示，科学家们已在不同种细胞来源的外泌体中发现了超过7 500 种RNA[2]。其中miRNA 作为外泌体的重要成分之一，已被证实在多种肿瘤中异常表达，这也为调节骨肉瘤细胞的转移性、早期诊断、临床肿瘤负荷的预测提供了一个新的思路。

1 外泌体的结构与功能

外泌体是指一种直径40 ～100 nm 的小囊泡，绝大部分细胞都可以产生外泌体，外泌体在不同体液中可以自由循环，其主要作用是通过将信息（如蛋白、RNA、DNA）转移到靶细胞，从而介导特定的细胞间通讯。在电子显微镜下，外泌体表现为由双层磷脂分子包裹，形态呈扁形或球形小体，还有些形态为杯状；其在体液中的存在形式以球形结构为主，通常可在蔗糖密度梯度溶液中密度为1.13 ～1.19 g/mL时获得富集[3]。

肿瘤源性外泌体最早于1981 年由Trams 等[4]发现并阐述，因其具有生物活性而进入科学家们的视野，研究者们发现肿瘤细胞可以分泌比正常细胞更多的外泌体，而且肿瘤细胞所分泌的外泌体中具有更多的miRNA（即MicroRNA，是一种长18 ～25 个核苷酸的非编码序列）。肿瘤来源的外泌体其内容物具有高度的可变性并且依赖于细胞来源，但是无论其来源如何，肿瘤来源的外泌体对于受体细胞来说都具有很强的功能性，其对于调节肿瘤细胞的转移性主要表现在3个方面:肿瘤细胞通过分泌外泌体，直接引发肿瘤的转移[5];肿瘤源性外泌体以miRNA 为媒介，调节肿瘤细胞生长的微环境[6];肿瘤源性外泌体通过改造远处的间质细胞，间接促进肿瘤的转移，如富含TGF- 1 蛋白的肿瘤源性外泌体可以促进静息状态的成纤维细胞转变为肌成纤维细胞，同时还可以促进新生血管的形成，间接促进了肿瘤的转移[7]。目前令人欣喜的是近年来在乳腺癌的研究中，研究者们发现可通过外泌体在不同转移性的细胞之间传递miRNA，从而达到改变肿瘤细胞转移性的效果[8]。最近亦有研究表明，可采取调节miRNA 表达的方法，通过外泌体介导的特异性细胞间通讯，从而影响骨肉瘤细胞的转移。

2 miRNAs 从细胞分选至外泌体的相关机制研究

外泌体成分复杂，包含了多种生物信息，因其中的miRNA 具有基因表达效应，故而受到最大的关注。Goldie 等[9]针对神经突触的研究指出，外泌体中的miRNA 浓度甚至高于分泌其的细胞本身，miRNA 是通过细胞内定位的动态模式传递或产生的，其分泌至外泌体的机制可能存在着翻译以外的动态组合机制。Guduric-Fuchs 等[10]分析了HEK293T（人胚胎肾上皮细胞）、HMEC-1（人微血管内皮细胞）等多种细胞及其分泌的外泌体，发现miRNA 的子集（如miRNA-150、miRNA-451、miRNA-142-3p 等）会优先进入外泌体，其中又以miRNA-451 富集程度最高。根据目前的研究，miRNA 分选进入外泌体可能存在3 种途径:神经鞘磷脂酶2（nSMase2）依赖性途径，nSMase2 是与miRNA 分泌到外泌体有关的第一个分子，Kosaka 等[11]发现nSMase2 的过表达会增加外泌体中miRNA 的量，而一旦nSMase2 受到抑制，外泌体中miRNA 就会相应的减少。miRNA 3'末端的序列依赖性途径，Koppers-Lalic 等[12]发现从B 细胞及尿液来源的外泌体大多含有内源性的miRNA 尿嘧啶核苷酸的3'末端，而B 细胞来源的外泌体还大多含有内源性miRNA腺嘌呤核苷酸的3'末端。这说明了miRNA 的3'末端可能含有了关键的分选信号。miRNA 诱导的沉默复合（miRISC）途径，众所周知，成熟的miRNA 可以与装配蛋白相互作用形成一种称为miRISC 的复合物。miRISC 主要包括miRNA、AGO2、可被miRNA 抑制的mRNA，AGO2 是一种倾向于结合在miRNA5'末端的尿嘧啶核苷酸或者腺嘌呤核苷酸的蛋白质[13]，其主要作用一是在mRNA 形成miRNA 这一过程中起调节作用，二是抑制或者降解mRNA 分子。最近的研究认识到AGO2 与外泌体中miRNA 的分选存在相关性，Guduric-Fuchs 等[10]发现在敲除AGO2 后，那些优先装配到外泌体中的miRNA（如miRNA-150、miRNA-451、miRNA-142-3p）会明显减少。由此可见，某些miRNA 中存在的特异性序列可以引导一些miRNA 进入外泌体，而一些蛋白质也可能参与了miRNA 的分选。

3 外泌体中的miRNAs 在骨肉瘤转移中的应用

值得一提的是，Shimbo 等[14]对于骨肉瘤细胞的研究很好提示了miRNA-143 在骨肉瘤转移性发面的远大前景，他们通过脂质转染的方法将miRNA-143 转染入骨髓间充质干细胞（MSCs），同时引起了细胞外与细胞内的miRNA-143增加，通过波谱分析可知细胞外的miRNA-143 都位于外泌体中，之后将miRNA-143 以外泌体的形式用于培养143B 细胞，通过细胞增殖及细胞迁移实验观察到，该种细胞的迁移性较实验前得到了很好的抑制。此外还有几项与miRNA-143有关的实验，有研究者通过构建小鼠骨肉瘤模型，将143B细胞接种于小鼠，同时将miRNA-143 转染进143B 细胞中，发现骨肉瘤的肺部转移得到了很好的抑制，同时还发现MMP-13（即金属基质蛋白酶-13，是一种蛋白水解酶）是miRNA-143 在这些靶基因中下调最明显的蛋白质，在临床样品中，所有的肺转移阳性病例中均观察到MMP-13 中等阳性或强阳性。这些数据表明，miRNA-143 的下调导致骨肉瘤细胞中MMP-13 表达的上调，并促进了原发病灶的肺转移[15]；因此，将miRNA-143 模拟物递送到肿瘤细胞中可通过至少抑制MMP-13 表达来防止骨肉瘤的肺转。Li 等[16]针对miRNA-143 与TGF- 1 信号通路的关系展开研究，他们分析了60 例骨肉瘤组织与邻近周围组织，发现TGF- 1 信号通路可以抑制miRNA-143，从而上调多功能蛋白（Versican，一种来自成纤维细胞的蛋白聚糖）的表达，借而影响骨肉瘤细胞的转移。Wang 等[17]针对癌症相关成纤维细胞（CAF）的研究证明了多种miRNA 对骨肉瘤转移性的影响。在此项研究中，科学家们使用miRNA 微阵列分析，鉴定了13 种miRNA，这些miRNA 在源自癌症相关成纤维细胞（CAF）和相应的癌症成纤维细胞（PAF）的外泌体中且表达显著增加。体外研究进一步验证了miRNA-1228 的水平在CAFs 分泌的外泌体和骨肉瘤细胞中增加，其可以下调骨肉瘤中的内源性SCAI（癌细胞侵袭抑制因子）水平。此外，此项研究提供证据表明CAFs 外泌体来源的miR-1228 能够通过靶向SCAI 促进骨肉瘤的侵袭和迁移。

Tsai 等[18]研究了CTGF（结缔组织生长因子）调节miRNA-519d 而影响骨肉瘤细胞的转移性，CTGF 过度表达时，miRNA-519d 下调十分明显。之后研究者们使用qRT-PCR证实了这点。他们将MG-63 细胞和U-2 OS 细胞与rCTGF（5 ～50 ng/mL）温育24 h，通过qRT-PCR 检查miR-519d表达情况。用miR-519d 模拟物或抑制剂转染细胞24 h，并通过Transwell 测定检查细胞迁移。结果发现CTGF 过度表达确实可以通过下调miRNA-519d 抑制骨肉瘤的转移。更令人瞩目的是，作者通过小鼠构建了动物模型，6 周后处死小鼠并取肺组织活检，进一步验证了结论。由此可见，miRNA不仅可以通过信号通路影响细胞的转移，更可以直接通过细胞因子传递生物信息。

和以上研究不同的是，Gong 等[19]采用相似的研究方法验证了同类细胞外泌体中的miRNA 也可以传递生物信息，首先他们利用慢病毒在高转移性的Hos 骨肉瘤细胞中过表达miRNA-675，之后利用外泌体中的miRNA-675 调控非转移性的成骨细胞hFOB 1.19，通过Transwell 实验及划痕实验验证其转移性前后的变化，发现hFOB 1.19 的转移和侵袭能力得到了提升，miRNA-675 可下调下游基因CALN1 的表达，同时证明了在上调的miRNA-675 和下调的CALN1 与骨肉瘤患者的肺转移有关。虽然纳入该项实验的患者数量只有8 人，但考虑到骨肉瘤的发病率，依然有着很强的说服力。

4 外泌体中miRNAs 在骨肉瘤转移诊断及治疗中的应用

骨肉瘤的早期诊断、早期规范治疗一直是临床医生的目标，近5 年来外泌体的研究证明，miRNAs 有望成为骨肉瘤早期诊断的新希望。而血液中的RNA 极不稳定且容易降解，这使我们难以检测循环中相关的miRNA 含量，但是由于外泌体膜的保护，使得外泌体中的miRNA 相对稳定，也为miRNA 的诊断用于临床增加了信心。目前研究显示，血清中的miRNA 作为肿瘤标志物已经在结肠癌（miRNA-22[20]、miRNA-143[21]）及乳腺癌（miRNA-10b[22]）的诊疗中取得了进展。随着外泌体纯化技术的进步，富集外泌体的方法也变得多种多样，其主要包括超速离心法、密度梯度分离法、免疫捕获效应等方法，其纯化的手段不同，外泌体内容物含量也会有所不同。Fujiwara 等[23]通过检测骨肉瘤患者血清，发现236 种miRNA 高于正常人，其中又发现miRNA-17-5p 及miRNA-25-3p 同时在骨肉瘤细胞及骨肉瘤细胞分泌的外泌体中表达上调，而miRNA-25-3p 上调最为明显，更进一步证明了血清中miRNA-25-3p 的水平与患者的预后和肿瘤负荷密切相关，此种miRNA 可能成为肿瘤检测及患者预后评估的生物标志物。

一项涉及48 例骨肉瘤患者的研究指出，外泌体中的miRNA 还具有着评估患者对化疗反应的作用，Xu 等[24]针对患者的血液，使用高速离心法提纯外泌体后，每个独立样本进行RNA 的阵列表达，他们研究分析了多种外泌体中的miRNA 指出:外泌体中的miRNA 在预测化疗反应差的患者的预后时具有临床意义，同时miRNA-148a、miRNA-133、miRNA-27a等8 种miRNA有望成为化疗反应差的骨肉瘤患者的生物标志物。不同种类的miRNA 调节骨肉瘤转移性的研究已经非常丰富，但外泌体作为一个新兴的研究热点，其不仅为人为调控miRNA、影响骨肉瘤的转移性提供了新的平台，更有可能应用于临床，评估骨肉瘤患者的转移风险。

5 展望

外泌体作为一个新兴的研究热点，给miRNA 调节细胞增殖、迁移提供了一个新的可操作性平台，虽然迄今为止骨肉瘤的转移在临床上是一个治疗难点，但通过上调或下调外泌体中的miRNA 可为干预骨肉瘤转移提供新的希望。