反向遗传学技术在麻疹病毒属病毒中的研究进展

石晓玲，和伟程，潘晓梅，田永强，柏家林

(1.兰州交通大学 化学与生物工程学院，甘肃 兰州 730070；2.西北民族大学 生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；3.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

麻疹病毒属属于副黏病毒科副黏病毒亚科，包括麻疹病毒(Measles virus,MV)、犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)、牛瘟病毒(Rinderpest virus,RPV)、海豹瘟病毒(Phocine distemper virus,PDV)、鲸类动物麻疹病毒(Cetacean morbillivirus,CeMV)和小反刍兽疫病毒(Pestedespetitsruminants virus,PPRV).麻疹病毒属病毒的核酸为单股负链RNA，基因组不分节段，长约16 kb，编码六个结构蛋白，分别为核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，N)、磷蛋白(Phosphoprotein，P)、基质膜蛋白(Matrix protein，M)、融合蛋白(Fusion protein,F)、血凝蛋白(Hemagglutinin，H)、大蛋白(Large virus-specified RNA polymerase protein,L)和两个非结构蛋白C和V，顺序为N-P-M-F-H-L.牛瘟病毒虽然已经被消灭，但麻疹病毒、小反刍兽疫病毒和犬瘟热病毒对动物及人的危害仍然很大，反向遗传学操作为解决这一难题提供了较为可靠的技术保障. 反向遗传学技术是相对于经典遗传学研究而言，主要通过构建RNA病毒的感染性克隆，在cDNA水平上进行体外操作(如核苷酸序列的突变、缺失、插入等)，然后通过体外转录技术获得子代病毒，进而对病毒基因结构、功能，以及表型性状等方面进行研究的方法.因此，又被称为“病毒拯救(the rescue of virus)”[1].1978年Taniguchi等首次在基因水平上进行遗传修饰，构建出Qβ噬菌体，并转染大肠杆菌完成了病毒的复制周期[2]，之后这一技术又被应用于脊髓灰质炎病毒[3].1994年Conzelmann等针对负链RNA病毒狂犬病病毒(Rabies virus，RV)基因组构建了一个能够高效表达外源基因的表达载体[4]，这些工作均为病毒RNA的结构和功能的研究奠定了基础.如今，大多数病毒都成功建立了各自的反向遗传学操作系统，并已广泛应用于生命科学的各个领域.本文综述了反向遗传学技术在麻疹病毒属病毒基因结构与功能、致病机制、感染性克隆构建及新型疫苗研制等方面的研究进展.

1 反向遗传学在麻疹病毒研究中的进展

早在公元7世纪，就有该病的记载，并被称为“比天花要可怕得多”的疾病.1954年Enders和Peebles首次分离出该病毒.在麻疹病毒属中，其应用最为成熟和广泛.1995年，Radecke等成功建立第一个麻疹病毒的反向遗传学系统，且应用于标记疫苗.通过筛选稳定表达的细胞系，拯救了子代病毒，发现有三个核苷酸突变，又将F蛋白的5'UTR中缺失504个核苷酸，均与Edmonston B(Ed)株的复制行为相似[5]；Schneider等在噬菌体的痘病毒载体中，限制了T7 RNA聚合酶的表达，这为研发新型麻疹疫苗奠定了基础[6].此后，MV拯救系统逐渐兴起.

Parks等显著提高了拯救效率，将转染的293细胞和Vero细胞共培养，或共转染质粒进行加温处理[7].以上均以Ed株为基础进行的改造.直至2000年日本的科学家在B95a 细胞中拯救IC-B 毒株，为高致病性毒株的拯救带来了希望[8].2005年发现了高效的逆转录基因系统，在CHO细胞中稳定表达SLAM，获得较高的拯救效率[9].次年开发了一个包含多个外源转录单元的拯救系统，为研究负链RNA病毒中外源基因的插入与否提供了实验依据[10].迄今为止，在麻疹病毒属中MV的拯救系统研究最广泛，这也为麻疹病毒属病毒的研究、疫苗开发及其他研究奠定了基础.反向遗传学作为一种研究方法，以病毒致病机理、疫苗研发、基因治疗等在麻疹病毒中应用最多，还有其他应用，但并不成熟.

为了验证非结构蛋白C和V是否对MV增殖的影响，构建了衍生株MV C-Ed，其中C蛋白的编码区以点突变的方式进行基因沉默，拯救的突变体可在细胞中增殖，且没有其他显著变化[11].Patterson J B 等验证了缺失重组体MV(C-)和(V-)与亲本疫苗株Ed在Vero细胞中都具有生长特征和病变效应.在体内，都以相同剂量(10-3)接种小鼠，10～15天后，Ed株小鼠死亡，而MV C-或MV V-有温和的临床症状和低的死亡率.免疫组化显示MV C-和MV Ed有相似程度的扩散，但限制了MV V-在整个脑中的扩散.因此MV C-和V- 蛋白在体内通过不同的机制起作用[12].张勇侠等通过改造麻疹病毒S191株，并在基因间插入GFP，获得拯救病毒，将二者共转染BSRT7细胞，热休克后感染Vero-SLAM细胞系，成功拯救到两种有活性的病毒[13]；王健等用全基因合成方法获得麻疹减毒活疫苗S191，共转染293T-3-46 细胞系拯救出麻疹病毒[14]；汪一龙等在BHK-SR19-T7细胞共转染质粒的方法成功对S191株进行了拯救，同时研发成功了mRNA甲基转移酶缺陷疫苗株[15]，为今后研发新型麻疹疫苗提供了新方向.

为探究嵌合麻疹病毒，将MV Schwar疫苗株F和H被猿类免疫缺陷病毒SIVmac239株的gp160包膜蛋白取代.利用CD4+靶细胞，在高滴度时，病毒形态与亲本MV颗粒相同.改变了病毒从CD46+细胞向CD4+细胞的趋向性.这得益于HIV样趋向性和MV在树突状细胞、巨噬细胞和淋巴细胞中复制的能力，可作为HIV候选疫苗[16].胡孔新等用MV敏感细胞系B95a，建立CC- 47株麻疹病毒的有功能的RNP，从而获得拯救病毒，连续传代，仍能检出病毒抗原和核酸[17]；修梅红等发现提高拯救麻疹病毒微复制子效率，并构建了Vero细胞系.将反向插入报告基因的微复制子感染细胞，发现均能表达[18]，这为发展病毒载体提供了技术平台.

Singh M等将白细胞介素12(IL-12)的2个亚基P35和P40基因插入到麻疹毒基H和L基因序列之间，进行拯救且传代培养10代，仍稳定表达，同时MV的复制不受影响.证实MV可用来表达外源基因进行免疫预防和基因治疗[19].Muhlebach MD将病毒基因组各自的抗基因组以及核糖核蛋白复合物的所有蛋白质克隆到MV疫苗株中进行拯救，然后在适当的临床动物模型中评估它们的免疫原性[20].

2 反向遗传学在犬瘟热病毒研究中的进展

CDV于1905年首次发现，直到2000 年，Gassen等用Onderstepoort(OP)株在HeLa细胞中，拯救出与母本毒株相似生长特性的病毒[21]，为CDV的结构和功能及新型疫苗载体的研究奠定了基础.尽管CDV的反向遗传操作系统建立的较早，但应用相对集中，主要为嵌合病毒和标记疫苗.

Parks CL等在全长基因中插入荧光素酶外源基因，成功构建了表达荧光素酶的rCDV[22]；Fujita等用同样的方法，感染多种宿主细胞.随着侵染B95细胞的变化，对SLAM受体的影响更显著；但侵染HEK293细胞时，磷脂样蛋白的表达反而降低，同时CDV的感染效率也下降，进一步验证了磷脂样蛋白介导感染细胞是通过F、H蛋白与磷脂样蛋白的稳定结合来发挥作用的[23].Plattet P等对 A75/17 株插入EGFP 基因[24]；同样，SiLin D等在CDV 的L蛋白中插入EGFP基因，导致病毒不能正常复制，证明了EGFP基因的插入使病毒显著致弱，且产生中和抗体，为新型疫苗的研究提供了新的方向[25]；闫小更等成功拯救rCDV11在Vero细胞上，同时研究了EGFP基因插入不同位置对病毒复制的影响，证明了在P-M基因之间插入，能稳定、高效地表达，并且具有良好的遗传稳定性[26]，为标记疫苗的研究奠定了基础.李丹丹等成功构建了CDV-SH株的感染性克隆[27]；李智丽在BHK-T7细胞系成功拯救病毒.将狂犬病毒Flury-LEP株G蛋白和水貂肠炎细小病毒VP2蛋白基因插入病毒基因组，拯救重组病毒并探究作为活病毒疫苗载体的能力[28].

Messling等用OP 疫苗株，将CDV的5804、OS和OL株和MV Ed的H蛋白互换，研究了重组病毒与亲本株在融合原性、生长特性及趋向性的差异，证实H基因对病毒的宿主细胞嗜性和致病性起着重要作用[29].Plattet P等将CDV的OP株与A75/17株的F、H、F+H基因进行了互换，并在Vero、Vero-SLAM细胞中评价融合性，表明细胞融合过程中F基因有显著作用.此外，SLAM受体也有促进作用[30]；Dietzel等将CDV病毒的OP株的M基因与5804P株的相应基因互换，重组病毒在Vero-SLAM细胞上生长显著增加，也影响了细胞膜中病毒囊膜糖蛋白的分布，使病毒粒子减少，单位时间内的生长滴度也降低.同期证明重组病毒能使雪貂产生轻微的症状，验证了M蛋白在病毒弱化方面产生了很大的作用[31]；Wang X等制备了表达狂犬病毒糖蛋白(RVG)的疫苗株.重组病毒在Vero细胞培养与亲本株有相似的生长特性.经动物实验，证明rCDV-RVG对小鼠和犬是安全的，可诱导对RABV和CDV产生强而持久的病毒中和抗体应答.首次研究表明，重组CDV有潜力作为动物狂犬病和犬瘟热的二价活疫苗[32].

3 反向遗传学在牛瘟病毒研究中的进展

牛瘟早在公元 4 世纪中国就有记载.2011年，世界动物卫生组织正式宣布，牛瘟病毒已成功被人类消灭.1997年Baron M D等用表达T7RNA聚合酶的操作系统，成功拯救出牛瘟病毒的全基因组序列，获得RBOK疫苗株[33]，证明了该技术在牛瘟病毒中成功应用，并为今后反向遗传学技术在牛瘟病毒中提供了技术平台.

Banyard等在RPV基因组中插入EGFP基因，实时观察重组病毒的复制情况，揭示了病毒在受感染动物的不同组织中的复制过程[34]，也为PRV的标记疫苗提供了有力验证.

Das S C等成功制备了嵌合疫苗.用PPRV的F和H基因替换RPV的相应基因，其中用T7 RNA聚合酶和重组禽痘病毒在Vero细胞中，研究发现仅替换一种基因时没有发现病变，但同时替换F和H基因时，病毒特异性功能将会联合作用，表明F和H基因同时存在时，可成功拯救牛瘟病毒.免疫山羊后，可保护山羊免受PPRV攻击，并成为理想的PPRV疫苗株[35].同样，ParidaS等也拯救了嵌合病毒.RPV N基因开放阅读框被PPRV N基因替换，免疫牛后，并未发生副作用.另外，将RPV的N蛋白的C 端可变区进行原核表达，制备蛋白，免疫动物，通过标记疫苗来区分疫苗毒和野毒的感染[36].

4 反向遗传学在小反刍兽疫病毒研究中的进展

小反刍兽疫病毒在1942年首次被发现，它是类似于牛瘟的一种疾病.1979年被列为麻疹病毒属的第4个成员[28].在成功消灭牛瘟病毒之后，世界动物卫生组织(OIE)和粮食及农业组织(FAO)制定了到2030年在全球范围内消灭小反刍动物(PPR)的目标.为了支持根除计划，我们用反向遗传学技术对PPRV核酸水平进行了改造，以探究病毒基因结构和功能等，对子代病毒的感染性和遗传特性的影响.小反刍兽疫病毒微型基因组系统于2007年被发现[37]，证明了PPRV反向遗传操作系统的可行性，也为PPRV的各项研究提供了新的平台.但是，该方法还不成熟、不完善.因而在该病毒的应用中并不多，其主要集中在嵌合病毒和标记疫苗方面的研究.

胡倩倩首次建立了表达GFP的重组PPRV，与亲本毒在体外复制能力、免疫原性等方面没有明显区别，且该病毒可稳定表达GFP蛋白[38]；Muniraju M等通过突变H蛋白三个氨基酸，在体外与野生株对比并没有显著变化，但在体内评估后，H突变体在山羊体内提供了充分的保护[39].近期，Liu,F等在体外高效表达eGFP，并根据重组PPRV的绿色荧光跟踪特性，选择8个哺乳动物细胞系，鉴定其对PPRV感染的敏感性.结果表明，仅比较8个细胞单层中绿色荧光细胞的比例，Vero和PK15细胞系对其感染的敏感性最高和最低[40].这为今后研究PPRV致病机理及PPRV为载体的新型疫苗研究奠定了基础.

该病毒是传递免疫原性蛋白的理想疫苗载体.2012年研制了蓝舌病、小反与兽疫二联活疫苗.通过构建表达蓝舌病毒VP5和VP7蛋白的重组PPRV，且接种山羊可诱导产生PPRV和BTV的抗体[38]；Yin C等构建了表达亚洲I型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白的重组PPRV病毒，接种山羊可诱导产生中和抗体，表达FMDV VP1蛋白的重组PPRV是针对PPRV和FMDV的潜在双活体载体疫苗[41]；Liu,F等在体外拯救重组SRMV表达颗粒状EG95抗原.虽然比亲本病毒复制速度慢，但可以在细胞中有效表达EG95抗原.如果在未来的动物实验中能诱导对这两种疾病的有效免疫反应，将会成为双价疫苗的潜在候选[42].以上为今后研发安全有效的二联活疫苗奠定了基础. 翟军军等制成DNA疫苗，基因组进行克隆最终连接至pok12载体，并免疫山羊，说明DNA疫苗和弱毒疫苗一样能够诱导山羊产生特异性反应[1]；Muniraju M从北非分离出的Morocco/2008株，并用体外转录的方法进行拯救[43]，为PPR新型疫苗的研制提供了新的思路和方向.

5 展望

综上所述，近年来，国内外多数科研平台先后建立了动物RNA病毒的反向遗传操作系统，技术层面更加简便高效.其中此方法对麻疹病毒属病毒进行有目的地改造，使病毒的生长周期和致病性、基因组的结构与功能、新型疫苗和载体构建等方面的研究有了很大改进.相信以后还会不断有新发现或新改造的生物载体，获得更理想的重组病毒，而达到扩大反向遗传操作技术应用的广度和深度.