慢性HBV感染免疫耐受期研究现状

周 培 渠淑云

1.西藏民族大学附属医院 ( 陕西 咸阳, 712000) 2.核工业二一五医院

慢性HBV感染仍呈现世界性流行。因新生儿免疫系统未发育成熟，缺乏特异性免疫反应或免疫反应呈现一个低水平状态，HBV经母婴传播后，导致HBV持续感染。研究表明，90%的新生儿HBV感染后可变为慢性，有30%的1～5岁儿童感染HBV后变成慢性，但成年HBV感染后，仅有1%～5%转变为慢性[1，2]。大多数研究表明机体免疫耐受状态是导致HBV持续感染及慢性化的关键因素，并且国内外指南均不推荐在免疫耐受阶段给予抗病毒治疗，因此这个阶段患者很难获得有效的抗病毒疗效[3]。本文就慢性HBV感染免疫耐受的命名争议、与母婴传播的关系、机制及治疗方面做一综述，以指导临床个体化抗病毒治疗方案。

1 HBV感染免疫耐受命名的由来和争议

1972年Sherlock等[4]首次在Lancet上发表研究，认为HBV感染是自限性感染还是有不同程度肝损伤的持续感染，是由T淋巴细胞介导的免疫系统决定的，高表面抗原载量可引起免疫耐受，导致轻微或无肝损伤，但病毒仍会持续复制。1983年Liaw等[5]在Gastroenterology上发表研究，表明HBeAg血清转换前突然发生的转氨酶的升高和组织学肝炎的发作，可能使宿主免疫应答增强导致HBeAg消失。1985年Liaw等[6]将慢性HBV感染分为免疫耐受、免疫清除和残余整合3期。2006年Yim等[7]首次将慢性HBV感染自然史分为了免疫耐受、免疫清除、非活动携带状态和再活化4期。此后一直按以上4期划分HBV慢性感染自然史，直到2015年Antonio 等[8]对免疫耐受期概念提出了质疑，他们理由如下：在胎儿早期已经存在效应和调节免疫应答；新生儿和婴儿可产生病毒特异性T细胞应答；新生儿和婴儿的免疫系统本身并无缺陷；出生时暴露HBV的新生儿可产生HBV特异性T细胞应答；儿童在1岁内注射乙型肝炎疫苗有免疫应答。Mason等[9]检测了26例慢性HBV感染者的肝组织和外周血标本，分为免疫耐受期(9例)、HBeAg(+)活动性肝炎(10例)及HBeAg(-)有活动性感染(7例)3组：3组均检测到HBV DNA整合、克隆性肝细胞扩增和HBV特异性T细胞存在，表明在慢性HBV感染的免疫耐受期已启动了免疫应答，并有疾病的进展，启动了肝癌的发生，因此建议将免疫耐受期改称为高复制低炎症期，并认为免疫耐受期患者可有组织学病变和肝纤维化，与免疫活动期患者无区别。因此，他们认为免疫耐受期的HBV感染不一定是良性的；免疫耐受期患者有HBV DNA整合，这是进展为肝癌的最初事件，是宿主DNA很高水平损伤的替代标志；免疫耐受期患者有克隆性肝细胞增殖，这是发生肝癌的危险因素；免疫耐受期患者的外周血抗HBV的T细胞数量与免疫活动期患者无明显区别，说明免疫耐受期可能已存在破坏肝细胞的T细胞。Protzer等[10]临床研究表明，高复制低炎症的免疫耐受期患者已启动肝癌的发生，并认为慢性乙型肝炎病(CHB)期和治疗结局命名需要修改。但Milich[11]不认为现已有足够证据将慢性HBV感染免疫耐受期改为高复制低炎症期，高复制低炎症期术语是描述性的，而免疫耐受期一词解释了高复制低炎症状态的机制，此外，需要考虑尽量用免疫学参数定义慢性HBV不同时期，因为一些肝炎主要是免疫介导的。2017年Liaw等[12]发表论文表示从临床观点考虑他们同意Milich的意见，认为免疫耐受期的术语和概念仍然是正确的。目前为止有关免疫耐受期的命名争论仍无明确结论，全球将HBV感染自然史命名分为两种：一是以美国肝病协会(AASLD)为代表的命名，即免疫耐受期、免疫清除期、非活动携带状态和再活动期[13]；二是以欧洲肝病协会(ESAL)命名为代表的，即HBeAg(+)HBV慢性感染、HBeAg(+)HBV慢性肝炎、HBeAg(-)HBV慢性感染及HBeAg(-)HBV慢性肝炎[14]。

2 免疫耐受与母婴传播

研究发现，HBeAg阳性和阴性孕妇所生新生儿中，脐带血中HBsAg阳性率分别为90%和30%～40%，可以认为高复制状态是宫内感染的高危因素，研究显示围生期感染HBV的患者大部分可发展为慢性肝炎。目前认为免疫耐受期人群以儿童和青少年为主，年龄越小，免疫耐受程度越高，HBV感染年龄是疾病慢性化的关键因素，这也说明免疫系统的成熟程度与HBV感染慢性化有关[15]。这种以儿童及青少年为基础的HBV感染，伴随HBV DNA高载量、HBeAg阳性、ALT水平正常、无或伴有轻微肝组织学炎症，并能持续几年甚至十几年而不会导致肝组织学进展的状态称为免疫耐受状态，也被认为是对幼小生命的一种保护机制，以减轻炎症因子对机体的打击[16]。

Song等[17]研究发现胎儿在子宫内暴露于母体产生的大量抗原中，其免疫系统发生一系列适应性改变导致胎儿免疫耐受母体产生的这些非遗传性抗原，这些改变成为了胎儿及新生儿的自身免疫防御漏洞，小分子量HBeAg能穿过胎盘屏障，使得未成熟的胎儿免疫系统认为HBeAg为自身抗原，针对其产生的未成熟的T及B淋巴细胞发生克隆消除，导致HBV的免疫耐受。新生儿出生后，这种克隆消除能进行，因此，婴幼儿一旦被HBV感染，自身免疫系统很难将HBV彻底清除，导致其慢性化。

动物实验研究表明，HBV转基因新生动物中有关HBV特异性的T和B淋巴细胞功能存在缺陷，从而导致HBV感染慢性化[18]。Tian等[19]对HBV感染小鼠研究发现，HBV的母婴传播可能与母体HBV感染后上调了PD-L1配体蛋白导致CD8+T淋巴细胞功能缺陷有关。但这些结果都建立在非自然感染的转基因动物实验基础上，并不能反映自然HBV感染状态，因此缺乏合适的动物模型也是研究乙型肝炎免疫耐受机制的主要障碍，但不能简单将免疫耐受原因归结于新生儿免疫功能不成熟或免疫缺陷，实际上新生儿早期就有全方位的免疫调节系统，并有能力在病毒感染后启动特异性T淋巴细胞对病毒进行清除[20]。Luzuriaga等[21]研究发现特异性HIV-1型特异性T淋巴细胞存在于HIV感染的新生儿体内，亦有研究表明在先天性巨细胞感染胎儿体内就存在δ和αβT淋巴细胞。研究还发现，新生儿暴露于病原体感染或接种活体疫苗都能“训练”其免疫系统对病原体进行自身免疫清除，病原体感染后，胎儿及新生儿建立起来的免疫系统能够得到“训练”，促使先天免疫细胞成熟及辅助性T淋巴细胞(Th1)的发育，这会增强胎儿脐带血中免疫细胞在体外的抗感染能力，这种效应也与IL-10较低、IL-12 P40及IFNa2水平在血清中较高有关[22，23]。因此，HBV感染引起的免疫耐受这一概念受到了质疑，例如，在HBV感染新生儿中发现了其DC细胞功能是完整的[24]。有研究在HBV感染母亲所生HBsAg阴性的新生儿(出生后接种过乙型肝炎疫苗)体内发现了针对HBV聚合酶及其核心的特异性T淋巴细胞免疫应答，并能够产生IL-2、IL-5、IL-6和IL-10炎症因子[25，26]。这些研究表明通过母婴传播的新生儿不一定存在T细胞的功能缺陷，相反，他们有启动HBV特异性T淋巴细胞的能力。

3 免疫耐受机制

HBV并不是直接导致肝细胞损害，而是引起免疫应答及其产生的炎症因子导致肝细胞损害，这些炎症因子的反复打击是CHB患者进展为肝硬化甚至肝癌的关键因素。HBV在体内清除主要机制是通过特异性免疫应答，组织相容性复合物(MHC)Ⅰ类分子限制性CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)可诱导感染肝细胞凋亡，分泌IFNγ，以非细胞裂解方式抑制相邻肝细胞内HBV复制，慢性感染时，HBV感染后分泌的HBeAg和HBX等多种小分子蛋白能干扰Toll-样受体(TLRs)和维甲酸诱导基因(RIG-I)两组抗病毒信号传导通路，分泌更多的IL-10，抑制CD8+T淋巴细胞的免疫功能，导致其功能耗竭，诱导对HBV的免疫耐受[27,28]。程序性死亡分子1(PD-1)/B7-H1信号通路表达的上调，也与HBV特异性CD8+T淋巴细胞功能耗竭有关，阻断其通路能增强抗HBV能力，因此，HBV特异性CTL功能缺陷是导致感染慢性化的原因之一[29]。但Kennedy等[30]研究表明,慢性HBV感染的青少年相对于成年人能产生更多的针对HBV特异性T淋巴细胞，并且能产生更多更有效的TH1型细胞因子，而并不表达出免疫耐受特征。HBV感染后，HBeAg可导致CD4+T淋巴细胞分化的Th1细胞亚群(分泌IFNγ、TNF等细胞因子，诱发细胞免疫来抗HBV感染)向Th2细胞亚群(分泌IL类细胞因子，诱导B淋巴细胞介导的体液免疫应答)转换，引起Th1/Th2比例失调，Th1分泌的细胞因子减少，功能减弱，导致HBV感染慢性化[31]。研究表明，IL-35能抑制HBV特异性CTL细胞增殖，减弱HBV细胞免疫反应，导致免疫耐受产生，与HBV感染慢性化相关[32]。Golsaz等[33]研究发现，慢性HBV感染患者髓系树突状细胞(mDC)配体PD-L1上调能抑制CTL的免疫功能，HBeAg能上调DC上Toll样受体3 的表达，导致IFNγ分泌减少，导致免疫耐受产生。HBV基因突变也与HBV感染慢性化相关，最常见的前S区缺失，可引起HBV包膜蛋白表达下调，导致T及B淋巴细胞能识别的抗原表位减少，从而逃避了抗-(前)S抗体的中和，导致免疫耐受，而前C区和前S区双突变可导致HBeAg 分泌减少，HBeAg表达于肝细胞膜上，成为免疫打击的目标，其分泌减少能够导致HBV免疫逃逸，促使HBV感染慢性化[34]。研究表明，宿主的基因多态性也与免疫耐受相关，全球范围内HLADRB1*11、*12和DQB1*0301等位基因与HBV持续感染有关，并通过meta分析发现rs7453920-G (HLA-DQ)和rs2856718-A(HLA-DQ)与HBV感染慢性化有关[35]。但在亚洲人群中，HLA-DPA1和HLA-DPB具有保护作用，能抵抗HBV感染慢性化[36]。

4 免疫耐受治疗

对国内外最新研究对免疫耐受的定义进行总结，我们将免疫耐受定义为HBsAg(+)持续6个月，HBeAg(+)，HBV DNA>107IU/ml，ALT和/或AST持续正常、肝活检或非侵袭性检查显示无或轻度炎症及无纤维化。但根据以上定义来筛查患者，仍有30%～40%患者有明显组织病理改变，部分患者是需要治疗的，因此免疫耐受期定义各国主要指南尚未达成共识。Chu等[37]对1241例HBeAg(+)非活动性HBsAg携带者(inactive HBsAg carriers，IHC)进行长达25年的随访研究发现其5年、10年、15年、20年及25年的肝炎复发率(ALT值>2正常值上限，HBV DNA载量高于最低检测值水平)分别为10.2%、17.4%、19.3%、20.2%及20.2%；肝炎复发与性别及年龄相关：随访20年发现26.9%复发患者为男性，12.5%复发患者为女性，13.1%复发患者年龄<30岁，29.4%复发患者年龄在40～49岁之间；还发现IHC患者逆转为HBeAg(+)率达20%；成为HBeAg(-)CHB者为20%～40%。Chen等[38]对20 069例IHC患者进行长达13.1年的随访研究发现，IHC患者年发生肝癌和死亡率分别为0.06%和0.04%，而对照组分别为0.02%和0.02%；与对照组相比，IHC患者的多因素调整危险比为肝细胞癌4.6(95%CI：2.5～8.3)及肝脏相关死亡2.1(95%CI：1.1～4.1)；他们得出结论，IHC患者与未感染HBV个体相比，具有肝细胞癌和肝脏相关死亡风险。Kim等[39]对413例免疫耐受期CHB患者(女性，ALT<19 IU/ml；男性ALT<30 IU/ml)及1 497例再活动期(ALT>80 IU/ml)CHB患者随访观察10年，发现两者肝细胞癌累积发生率和死亡率分别为(12.7%vs 6.1%；P=0.001)和(9.7%vs 3.4% ；P<0.001)，发现免疫耐受患者有更高的肝细胞癌发生率(HR 2.54，95%CI：1.54～4.18)及死亡率(HR 3.38，95%CI：1.85～ 6.16)，因此，CHB免疫耐受期患者如未经治疗，长期随访疾病仍有进展可能[39]。但Hui等[40]对57例CHB免疫耐受期患者[ALT正常(4～42U/L，HBV DNA>7.12 lg copies/ml，平均年龄31岁]进行长达5年随访，且每例患者都给予肝组织学检查，发现随访5年后其肝组织学HIA评分无显著变化(P=0.58)，HBV DNA载量无显著变化(8.35～10.00 lg copies/ml vs 9.20～10.00 lg copies/ml，P=0.02)；ALT水平无显著变化(17 U/L vs 14 U/LP=0.47)。Andreani等[41]对40例CHB免疫耐受期患者(ALT正常9～35 U/L，HBV DNA>7 lg copies/ml，平均年龄29岁)进行长达37.7个月的随访，发现12例患者丧失免疫耐受状态的平均年龄为30.7岁，其中6例患者转变为非活动状态，3例患者进展为慢性肝炎，3例患者ALT水平升高，处于免疫耐受期患者肝脏组织学进展轻微，然而，一旦进展到免疫清除期疾病进展迅速。因此，明确慢性HBV感染者是否真正处于免疫耐受期非常重要，对于是否给予CHB免疫耐受期患者抗病毒治疗是有争议的。北京佑安医院给HBV DNA <20 IU/ml的IHC患者给予PEG-IFNα-2a 治疗,而20 IU/ml ≤ HBV DNA< 2 000 IU/ml的患者给予PEG-IFNα-2a 联合阿德福韦酯治疗96周，发现48周和96周HBsAg清除率和血清转换率分别为29.8%、20.2和44.7%、38.3%，对照组HBsAg清除率分别为2.4%、0%和2.4%、0%，他们认为IHC患者接受以PEG-IFN为基础的抗病毒治疗疗效较好[42]。但现行国际指南关于免疫耐受期患者抗病毒治疗意见有争议，2016年AASLD指南不推荐对免疫耐受期成人进行抗病毒治疗[43]。

2017年EASL指南提出，对免疫耐受期年龄>30岁的患者，无论肝组织学的炎症程度如何，可考虑抗病毒治疗；年龄<30岁且不符合任何治疗适应证者，应至少每3～6个月进行1次随访监测[14]。虽然临床治疗方面有争议，但一致认为免疫耐受期过渡到免疫清除期阶段，当抗病毒治疗可能取得长期临床受益时，应及时启动抗病毒治疗。

HBV感染慢性化机制十分复杂，而目前大多数学者认为免疫耐受是其主要机制。目前研究者一致认为打破免疫耐受可终止慢性HBV感染，是清除体内HBV的根本治疗手段，但何时介入治疗才能打破免疫耐受，是否免疫系统未完全成熟的婴幼儿期为抗HBV治疗最佳时间点，是否有新的免疫指标能明确免疫耐受期等有待进一步研究。