普洱茶醇提物对非酒精性脂肪性肝病小鼠的肝保护作用研究*

贾 璐，柯 旺，李 襄，邢 玥，徐 梅，杨 隽，赵 荣，栾云鹏△

（1.西南林业大学生命科学学院，云南 昆明 650224；2.云南中医药大学第一附属医院， 云南 昆明 650021）

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种非酒精所致的，以肝脏中脂类所占比重过高及肝脏细胞脂肪变性为特征的临床综合征[1]。NAFLD是导致慢性肝脏疾病的主要原因。近年来随着相关代谢综合征和肥胖症在全球大范围流行，NAFLD的发病率也逐步升高且患者日渐年轻化，已成为我国较为普遍的疾病[2-3]。目前已知有多种原因可引发NAFLD，临床上最常见的原因是肥胖，约50%～75%的肥胖患者合并有不同程度的NAFLD，因此调节脂质代谢正常化对治疗NAFLD有积极意义。普洱茶是一类深受大众欢迎的保健茶，其浸出物包含茶碱、咖啡碱、茶多酚以及维生素等多种生理活性物质。近年来，普洱茶在解毒、降血脂、抑菌等方面有较多的应用研究[4-5]。本试验以高脂饮食诱导的NAFLD小鼠模型为基础，探讨普洱茶醇提物在改善脂质代谢紊乱及肝脏病理损伤中的效用，为开发安全有效的NAFLD干预保护及辅助治疗药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6周龄ICR小鼠50只，雄性，平均体质量（24.87±2.91）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产批次：SCXK（湘）2016-0002。小鼠在空调动物饲养室中同室群笼饲养，室温（22±2）℃，湿度40%～70%，自然光照，每日定时通风。自由采食和饮水，每日更换垫料、鼠笼并洗涤饮水瓶。

1.2 药物与试剂 基础鼠粮（江苏美迪森生物医药有限公司）；全脂奶粉（内蒙古伊利实业集团股份有限公司）；鱼肝油乳（国药控股星鲨制药厦门有限公司）。普洱茶（熟茶）（中国普洱茶研究院，编号：532721-616）；无水乙醇、石油醚、正丁醇、多聚甲醛（天津市致远化学试剂有限公司，AR）；苦味酸（台山市众城化工有限公司，AR）；TG、TC、AST、ALT 检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；HE染色试剂盒（上海榕柏生物技术有限公司）。

1.3 仪器 SW-CJ-2FD洁净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；摇摆式高速中药粉碎机（中国浙江温岭市林大机械有限公司）；TU-1901紫外/可见分光光度仪（上海菁华科技仪器有限公司）；旋转蒸发仪（德国IKA集团）；DMi1倒置显微镜（德国徕卡公司）；101-1AB电热恒温鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 高脂鼠粮制备 每100 g基础鼠粮加入猪油50 g，鸡蛋液 60 g，全脂奶粉 20 g，鱼肝油 50 g，食盐1 g，混匀搅拌成糊状，捏制成直径不超过5 cm的圆饼，放入微波炉大火烤5 min后翻面再烤5 min即得。

1.4.2 普洱茶膏的制备 普洱茶（熟茶）购自中国普洱茶研究院。茶样打磨成粉，过80目筛，取100 g茶粉与1 000 mL 95%乙醇混合进行抽提，重复3次后进行旋转蒸发，再冷冻干燥至恒重后即得固态胶状茶膏，保存于4℃，使用时以蒸馏水溶解茶膏得水溶剂，灌胃。

1.4.3 动物分组及给药 50只健康ICR小鼠适应性饲养1周后随机抽取10只作为空白对照，剩余40只用于构建NAFLD小鼠模型。在建模期间，空白对照组饲喂基础鼠粮，建模组饲喂高脂鼠粮，每隔1周记录小鼠体质量，持续至第19周。通过体质量变化及生理行为观测确认建模成功后，将40只NAFLD小鼠随机分为：模型组10只、高剂量治疗组15只、低剂量治疗组15只，对高、低剂量组进行为期6周的普洱茶干预治疗。治疗期间所有ICR小鼠均饲喂基础鼠粮，自由饮水；高、低剂量组额外增加普洱茶醇提物灌胃治疗。根据多项普洱茶提取物经口毒性试验结果，受试个体最保守 LD50为＞5.0 g/kg·bw[6-7]，设置高剂量为5.0 g/kg·bw，低剂量为 2.0 g/kg·bw，每日灌胃 1 次。

1.4.4 指标检测 每天进行生理行为观察，每周测量1次体质量。治疗期结束后采用颈椎脱臼法处死小鼠。通过眼眶静脉丛釆集全血，分离血清，测定血清中甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesteral，TC）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）的含量；取肝脏经液氮研磨后的上清液，测定肝脏中TG、TC、AST、ALT的含量。分离腹腔脂肪、肾周脂肪以及睾丸周围脂肪称重，计算体脂肪（体脂肪总量=腹腔脂肪+肾周脂肪+睾周脂肪）[8-9]。取小鼠肝脏称重，计算肝脏指数（肝脏指数=解剖时提取的肝脏湿重/断水断粮12 h后小鼠体质量×100%）。取部分肝脏置于4%多聚甲醛溶液中固定，经醇脱水、透明、石蜡包埋后制成切片，HE染色后进行组织学观察。

1.5 统计学分析 使用SPSS 22.0软件包对实验数据进行统计学处理，数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析法处理。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠体质量变化 实验初始，空白组与NAFLD建模小鼠采用随机分组方式，初始体质量（25.01±2.89）g、（24.57±2.67）g，组间体质量无差异。高脂鼠粮饲喂19周，NAFLD建模组小鼠明显表现出慵懒、行动缓慢、精神萎靡的症状，且毛发有油腻感，进食减少，体质量远高于空白对照组小鼠（P＜0.05），提示造模成功。建模完成后，治疗期起始（记为0周），连续灌胃6周，模型组、高剂量组、低剂量组小鼠体质量均高于正常组，但组间无统计学差异（P＞0.05）。普洱茶灌胃治疗期间，与模型组相比，高、低剂量治疗组平均体质量降低（P＜0.05），其中高剂量组体质量基本达到空白对照组水平，精神状态也有所恢复。以上结果表明，普洱茶醇提物能有效降低高脂饮食导致的体质量增加，并改善由此引发的异常行为表现，见表1。

表1 普洱茶对小鼠体质量的影响（±s，g）

表1 普洱茶对小鼠体质量的影响（±s，g）

注：与同期空白组比较，*P＜0.05；与同期模型组比较，△P＜0.05。

组别 N/支 0周 1周 2周 3周 4周 5周 6周空白组 10 39.15±3.79 40.12±3.50 40.67±3.84 41.25±3.28 41.83±3.11 42.21±2.78 42.61±3.04模型组 10 45.43±2.23* 46.21±2.78* 45.53±3.31* 45.72±2.95* 46.34±3.02* 46.58±2.46* 47.13±2.35*高剂量组 15 45.54±2.57* 45.43±3.56* 44.21±3.98*△ 44.52±3.78*△ 43.71±4.06△ 43.31±3.31△ 42.71±2.94△低剂量组 15 45.47±2.93* 45.44±3.12* 44.71±2.96*△ 44.84±3.18*△ 44.51±3.20*△ 43.71±3.59△ 43.52±3.16△

2.2 脏器及血清脂质含量变化 肝脏指数能在一定程度上反映肝脏的病理学改变。与空白组比较，模型组小鼠的肝脏指数显著增高（P＜0.05）。经过普洱茶醇提物治疗后，治疗组小鼠肝脏指数较模型组明显降低（P＜0.05），并呈现出一定的剂量趋势。治疗组小鼠体内储存性脂肪与模型组相比明显减少（P＜0.05），表现为腹腔及睾周脂肪含量虽仍高于空白组小鼠，相较于模型组同一部位的脂肪含量下降显著（P＜0.05）。以上结果表明，普洱茶能在一定程度上降低NAFLD小鼠体内脂肪组织沉积，在控制肥胖引起的肝脏重量增加方面效果更为明显，表现出良好的肝脏保护作用，见表2。

表2 普洱茶对NAFLD小鼠肝脏指数及体脂含量的影响（±s）

表2 普洱茶对NAFLD小鼠肝脏指数及体脂含量的影响（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。

组别 N/支 肝脏指数/% 腹腔脂肪/g 肾周脂肪/g 睾周脂肪/g 体脂肪总量/g空白组 10 3.32±0.13 0.12±0.04 0.21±0.12 0.19±0.08 0.52±0.15模型组 10 5.05±0.21* 0.18±0.04* 0.28±0.14* 0.71±0.21* 1.17±0.26*高剂量组 15 4.10±0.06△ 0.16±0.02△ 0.27±0.10 0.54±0.11△ 0.96±0.13△低剂量组 15 4.68±0.16△ 0.17±0.05△ 0.27±0.12 0.53±0.14△ 0.97±0.19△

甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）水平能进一步反映体内脂肪代谢的紊乱程度。与空白组相比，模型组小鼠肝脏组织和血清中TG、TC的含量明显升高（P＜0.05）。经普洱茶醇提物治疗后，高、低剂量组小鼠的肝脏与血清中TC、TG水平较模型组明显下降，并呈现出一定的剂量趋势（P＜0.05），表明普洱茶能够发挥调节脂质代谢、降低血清和肝脏中脂肪含量的作用，见表3。

表3 普洱茶对NAFLD小鼠肝脏与血清中TC、TG的影响（±s）

表3 普洱茶对NAFLD小鼠肝脏与血清中TC、TG的影响（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。

组别N/支肝TC/（mmol·L-1）肝TG/（mmol·L-1）血TC/（mmol·L-1）血TG/（mmol·L-1）空白组 10 1.51±0.06 0.71±0.12 1.10±0.08 1.24±0.09模型组 10 3.22±0.07* 2.12±0.16* 2.31±0.12* 2.98±0.21*高剂量组 15 2.14±0.12△ 1.02±0.03△ 1.33±0.17△ 1.96±0.08△低剂量组 15 2.70±0.09△ 1.72±0.11△ 1.63±0.15△ 2.25±0.16△

2.3 转氨酶ALT、AST活性 肝脏中富含各种转氨酶，其中ALT、AST是临床上常用的检测肝细胞受损程度的指标。与空白组比较，模型组小鼠肝脏和血清中AST、ALT的活性明显升高（P<0.05），提示肝细胞受损。经普洱茶醇提物治疗后，治疗组的AST、ALT水平都明显下降（P<0.05），且存在剂量依赖性。可见普洱茶醇提物在缓解肝细胞受损、降低转氨酶方面疗效显著。

表4 普洱茶对NAFLD小鼠肝脏与血清中ALT、AST的影响（±s）

表4 普洱茶对NAFLD小鼠肝脏与血清中ALT、AST的影响（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。

组别N/支肝ALT/（U·L-1）肝AST/（U·L-1）血ALT/（U·L-1）血AST/（U·L-1）空白组 10 47.30±3.23 21.00±3.98 92.85±4.99 49.35±6.59模型组 10 96.86±4.21* 52.71±2.25* 176.18±5.34* 77.16±2.26*高剂量组 15 60.69±4.65△ 29.56±1.32△ 118.45±6.47△ 55.95±6.55△低剂量组 15 82.91±3.87△ 43.18±2.51△ 143.98±3.56△ 64.84±6.54△

2.4 肝脏组织病理学观察 各组小鼠的肝脏切片经HE染色后置于低倍镜下观察，空白组肝脏组织小叶结构正常，肝细胞胞质丰富，染色均匀，细胞核明显，未见明显异常。NAFLD模型组中可见肝细胞肿胀，多数细胞内存在弥漫性脂肪空泡，并可融合成细胞内大的脂滴。这表明高脂鼠粮饲喂方式成功构建了NAFLD小鼠模型，且在不经药物处理，换喂基础鼠粮6周后，肝脏脂肪沉积状况并无改善。经普洱茶醇提物治疗后，不同剂量治疗组的肝脏病理情况明显改善，高剂量组肝脏虽还有许多脂肪空泡，但数量和大小较模型组已显著减少；低剂量组的改善效果较模型组不够明显。表明普洱茶醇提物对NAFLD肝脏细胞的脂肪变性具有较好的改善作用，且治疗恢复能力与剂量相关，见图1。

图1 肝脏组织HE染色（×200）

3 讨论

NAFLD是肥胖和代谢综合征（metabolic syndrome，MetS）累及肝脏的表现，治疗单纯性脂肪肝阶段的首要目标是减肥和改善胰岛素抵抗（insulin resistance，IR），预防和治疗 MetS、Ⅱ型糖尿病（T2DM）及其相关并发症，从而减轻疾病负担、改善患者生活质量并延长寿命[10]。在减肥方面，普洱茶作为一种传统降脂减肥茶备受欢迎。徐湘婷等[11-12]发现普洱茶汤能较好地抑制高脂模型动物的体质量与血脂，减轻高脂饲料诱发的大鼠肝脏脂肪变性程度，并且可能与抗氧化相关的超氧化物歧化酶SOD和GSH-PX活性有关，认为普洱茶可能通过抗脂质过氧化来调节血脂紊乱。熊昌云[13]探讨了普洱茶乙酸乙酯萃取层及水层分离物对小鼠体内脂肪代谢相关酶活性的影响，发现前者呈剂量效应降低小鼠体内肝脂肪酸合成酶活性及血清瘦素含量，并且二者在一定程度上抑制3T3-L1前脂肪细胞的活力和增殖，同时促进成熟脂肪细胞的脂解，减少其数量和体积，从而减少甘油三酯的整体含量。研究认为普洱茶主要通过茶褐素、茶多糖、茶多酚及发酵过程中微生物产生的他汀类物质直接影响食物摄入、吸收，抑制脂肪合成、加快脂肪分解，从而达到减肥降脂的效果[14]。Huan等[15]深入探讨了普洱茶中的茶褐素通过肠道菌群和胆汁酸代谢改善高胆固醇血症的机制，提示了肠道菌群在脂代谢中的重要作用。

本研究通过饲喂高脂饲料构建了NAFLD小鼠模型，建模成功后采用普洱茶醇提物进行灌胃治疗，各治疗组的肝脏指数、肝脏脂质和主要血脂指标与模型组相比都明显降低，证实普洱茶醇提物在降脂减肥方面有显著功效。相比水提物，普洱茶醇提物中主要含茶多酚、儿茶素类及没食子酸等，茶褐素、可溶性糖及可溶性蛋白等含量则明显偏低，提示普洱茶醇提物与水提物的降脂减肥机制可能存在差异[11]。针对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等的体外研究表明，普洱茶醇提物的抑菌效果显著，且95%醇提物抑菌效果强于水提物及75%醇提物[16-17]。由此我们推测普洱茶醇提物可能对实验小鼠的肠道菌群结构也产生了一定影响，进而影响到脂代谢的调节，对于该假设的验证实验还需进一步开展。

临床研究发现NAFLD患者肝脏和血清中ALT、AST的水平与正常个体存在差异，中度NAFLD患者的肝脏AST、ALT出现轻度或中度升高，而重度NAFLD会引起AST、ALT显著增高[18]。此外，当NAFLD由单纯性脂肪肝向非酒精性脂肪性肝炎（nonalco holic steatohepatitis，NASH）发展过程中，也伴随AST、ALT含量的明显上升，而NASH被认为是NAFLD进展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌的分水岭[19-20]，可见ALT、AST的含量是评估NAFLD的重要指标。本研究构建的NAFLD模型小鼠肝脏及血液中ALT、AST的含量远高于空白组，经过6周的普洱茶醇提物治疗后，二者含量均明显降低，表明普洱茶具有修复受损肝细胞并阻止NAFLD进一步向肝纤维化发展的功效。此外，治疗组小鼠腹腔、肾周及睾周脂肪量降低有限，高、低剂量治疗效果差异也不明显，而肝脏指数和肝脏脂质得到显著改善且与剂量相关，推测普洱茶醇提物在改善肝脏脂肪代谢方面更有优势，其具体作用机制有待深入研究。

虽然治疗组小鼠的各项指标较模型组有明显改善，但部分指标仍与空白组存在一定差距。例如治疗组小鼠仅体质量基本恢复到空白组水平，体脂、血脂、ALT、AST的含量虽呈下降趋势，仍高于正常组，可能与普洱茶醇提物成分或作用较为单一以及用药周期较短有关，另一方面也显示出干预和治疗NAFLD的复杂性。