深层过滤在口蹄疫疫苗生产工艺中的应用研究

范恒瑞，宋明宇，邱 瑾，吴 迪

(3M中国有限公司，北京 大兴 100176)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的偶蹄动物共患的急性、热性、接触性传染病，本病最易感染的动物包括牛、猪、羊等。口蹄疫在亚洲、非洲、中东和南美均有流行，发病率极高，传播速度极快。世界动物卫生组织将其列为A类人兽共患病首位，要求成员国将口蹄疫列入必须报告动物疾病的名录中[1]。疫苗接种是特异性预防FMD的有效手段。FMD灭活疫苗由完整病毒经过灭活剂灭活后制成，在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用[2]。

FMDV本身抗原性较差，病毒灭活后对其抗原的影响较大，所以现阶段口蹄疫疫苗生产中，高纯度的口蹄疫疫苗能保证单位使用剂量中抗原含量和纯度，这显得尤为重要，也是目前疫苗接种的策略。这对于病毒的下游纯化提出了很高的要求。另外，2009年以前，国内灭活口蹄疫疫苗上游多为采用转瓶贴壁培养方式，随着对于疫苗需求的提升，该培养方式需大量转瓶、效率低下、表达量低的弊端逐渐显现。因此，近年来细胞培养技术由以往的贴壁培养慢慢向悬浮培养转变，病毒产量得到了显著提高[3]。然而，随着病毒产量的提高，培养方式的转变，给下游纯化带来更大的压力，因为伴随培养过程产生的细胞碎片、细胞释放宿主蛋白、宿主DNA等相应也剧增，这对于下游纯化的能力提出了进一步的要求。

膜过滤技术广泛应用于疫苗等生物制品的生产过程中，其中直流过滤技术通常应用于病毒液的收获过程，用以分离细胞碎片等不溶性杂质。早期的FMDV澄清主要采用以折叠膜滤芯为代表的表面过滤技术；随着培养条件的变化，细胞碎片杂质的增多，表面过滤难以达到澄清效果，而且由于表面过滤载量较低，滤材成本也越来越高。在上述背景下，深层过滤在FMDV的胞液分离过程得到越来越多的应用。深层过滤滤材通常由天然来源的长细纤维构成，过滤介质成膜后形成的通道往往都十分曲折，类似迷宫式的孔径结构。杂质颗粒往往在滤材内部而非表面被截留捕捉。而且，过滤通道壁面往往会以静电作用或者分子间作用力的方式吸附一部分极其细小的颗粒杂质。总体而言，深层过滤的过滤机理表现为机械截留和吸附作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 口蹄疫疫苗细胞培养液BHK21 悬浮培养，经连续流离心工艺离心上清液。

1.2 主要仪器 2100Q便携式浊度仪，哈希公司产品；蠕动泵，Cole Parmer公司产品；47 mm过滤夹持器，3M公司产品；Zeta PlusTM深层过滤滤材，型号:60SP、60ZB、30SP、30ZB，3M公司产品。

1.3 恒流过滤方法 安装深层滤板至恒流过滤装置，用缓冲液PBS冲洗滤板54 L/m2以上；冲洗完毕后启动蠕动泵缓慢泵入料液，缓慢调节泵速至约预计流速，进行料液过滤；记录过滤过程滤出体积、时间、压差、浊度。收集滤出液进行抗原检测。

2 结果

2.1 深层过滤的优势 表面过滤是通过滤材表面对颗粒进行捕捉截留来实现过滤的技术。过滤机理主要是依据流体中颗粒大小进行筛分，大颗粒被截留在滤膜表面。深层过滤利用内部通道，在深度进行颗粒拦截以及吸附[4]。二者对比示意图如图1所示。

图1 深层过滤和表面过滤[5]

取某厂家的口蹄疫疫苗灭活液，分别采用0.45 μm 孔径的聚丙烯材质表面膜和深层滤板进行预过滤去除细胞碎片，然后再用0.2 μm孔径的除菌过滤器进行过滤。可滤性数据如表1所示。

表1 口蹄疫疫苗细胞培养液深层过滤和表面过滤可滤性测试对比

该口蹄疫疫苗灭活液浊度为77 NTU，如果直接进行除菌过滤，大量细胞碎片势必造成0.2 μm滤膜很快堵塞，进而影响146S病毒粒子的透过性。因此，在除菌过滤之前设计了预过滤，并且对比了深层过滤和表面过滤这2种预过滤方式。选取双层深层滤板30ZB+60ZB进行过滤，载量641 L/m2，深层过滤将77 NTU的物料降低至9.65 NTU，澄明透亮；而0.45 μm的表面过滤载量仅仅46 L/m2，滤出液浊度高达41 NTU，不适合作为预过滤。从后续0.2 μm 除菌过滤的载量对比上可见，深层过滤后除菌滤膜载量为655 L/m2，是对应表面过滤后除菌过滤载量(仅91 L/m2)的7.2倍。

146S检测结果表明，深层过滤系统收率整体高于表面过滤系统。深层过滤载量是表面过滤的13.9倍，滤出液浊度仅为表面过滤的23.5%，后续0.2 μm除菌过滤载量是表面过滤的7.2倍。因此，无论从成本角度还是从收率角度考虑，深层过滤系统都明显优于表面膜过滤系统。

2.2 强正电荷深层滤器的优势 针对不同来源的口蹄疫疫苗灭活液，采用正电荷深层滤板和强正电荷深层滤板进行对比测试。可滤性结果如表2所示，过滤过程滤速压差变化如中插彩版图2所示。

表2 口蹄疫疫苗细胞培养液强正电荷深层过滤可滤性参数

所采用的两组深层滤板具有一样的孔径精度，从载量、压差变化等角度看，表现非常一致，中插彩版图2中压差变化曲线也基本重合。但是从滤出液浊度来看，差异很大。普通正电荷的30SP+60SP双层滤板的滤出液25 NTU，而同样孔径的强正电荷深层滤板30ZB+60ZB双层滤板的滤出液仅9.65 NTU，仅为普通深层滤板的38.6%。这主要得益于强正电荷深层滤板滤材中特殊的树脂配基。通过强正电荷双层滤板，浊度降低至10 NTU以下，细胞碎片被充分吸附或者截留，有利于后续超滤或者除菌过滤工艺。除了对于不可溶性的细胞碎片有吸附作用，Yigzaw Y等[6]还曾报道过强正电荷深层滤板对于细胞宿主蛋白的去除作用，Dorsey N等[7]报道过强正电荷深层滤板对于DNA的去除作用。

2.3 深层过滤对口蹄疫疫苗上清液的澄清过滤工艺建立 通过上述表面过滤和深层过滤的对比研究、特殊的强正电荷深层滤板澄清效果的研究，针对不同培养条件产生的口蹄疫疫苗灭活上清液，应该给予匹配不同的过滤方案。低浊度、中等浊度、高浊度3种不同浊度的离心上清液，深层过滤方案及相应过滤参数如表3所示。

表3 不同浊度口蹄疫疫苗细胞培养液的过滤方案

对于较低浊度的离心上清，单层深层滤板可以有效澄清，去除少量的细胞碎片；对于中等浊度的离心上清，双层深层滤板可以有效澄清，尤其是强正电荷的Zeta PlusTMZB系列滤板可以将浊度降低至5 NTU以下；对于较高浊度的离心上清，SP及ZB的组合滤板可以有效澄清。无论哪一种工艺，处理量均在500～800 L/m2，滤出液浊度均低于20 NTU，目标抗原均完全回收，适合规模化生产。

3 讨论

20世纪70年代，过滤介质被规定不得采用石棉材料，因为石棉材料中存在致癌物质。后来，科学家Cuno发明了Zeta PlusTM滤材，该滤材不含有石棉，但有更强的正电荷。该滤材由木质纤维基体和助滤剂混制而成，生产过程中利用高分子树脂连接基本成分，其中的正电荷功能基团有效赋予了深层滤材电荷吸附的能力。Hou K等[8]报道了Zeta PlusTM吸附型深层过滤在细小颗粒的捕捉能力上的优异表现，如图3所示。

图3 深层过滤介质静电吸附/机械拦截示意图[4,8]

本试验选取不同树脂成分、不同精度的Zeta PlusTM滤材对FMDV培养液进行澄清过滤测试，并与表面过滤进行对比测试。结果显示，深层过滤相对于表面过滤更加适合于细胞碎片的去除，有利于后续微生物负荷控制过滤单元(0.2 μm)。另外，通过对比强正电荷深层滤板和普通正电荷深层滤板的过滤效果，强正电荷的Zeta PlusTMZB系列滤板显示了极强的浊度控制能力，可以将浊度降低至5 NTU 以下，非常有利于提高整个过滤工艺的稳健性。

上游培养工艺对于有效成分收获步骤的影响巨大，本试验通过测试最终建立了针对不同浊度的细胞培养液的可规模化的过滤方案，对于大规模生产有一定指导意义。