蒲公英根提取物自微乳给药系统的处方设计

王丽娜，贾 皓，于 同，王 丹，陈 爽，李 研

(1.吉林医药学院药学院，吉林 吉林 132013；2.海南医学院基础医学与生命科学院，海南 海口 570000)

自微乳给药系统(Self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS)属于各项同性系统，其外观是澄清透明的，而且呈现稳定的热力学及动力学状态，可以在体内蠕动后或在体外加水搅拌状态下自发地进行乳化作用，其粒径为10～100 nm，是属于水包油(O/W)型的微乳[1-5]，在一定温度的条件下长时间地放置或离心后都显示比较稳定的状态，而且一般粘性都较小，因此可以通过过滤进行灭菌，极其便于操作；因为其形成的微乳粒径都比较小，所以可以作为纳米级别的给药系统，极大地增加了药物的表面积，同时也有利于对药物的吸收利用，还可以增大难溶性药物的溶出度，从而使难溶性药物在体内的生物利用度增大[6-8]。SMEDDS在口服后可以在胃肠道的蠕动下及胃肠道内水的参与下自发地形成水包油型微乳，能快速均匀地分布在胃肠道中，有利于增强胃肠道对药物的吸收利用；除了可以减轻药物对胃肠道的刺激外，还可以进一步增大体外的溶出度，同时还能使药物在体内的吸收率增大；另外，还可使胃肠黏膜的清除作用有效地降低，除上述之外，还可以避免首过效应，对防止药物被酶水解失活具有一定的作用，从而使药物的生物利用度增大，另外也可使药物在个体间的吸收差异降低，尤其适用于口服吸收效果差及生物利用度低的药物[9-11]。

蒲公英是一种极其常见的植物，拥有多种多样的别名，常被称为婆婆丁，也被称为黄花地丁等[12]。在全球范围内分布广泛，遍布于北半球温带至亚热带中部地区；我国也拥有非常多的蒲公英，大多分布在华北、东北、西南省区以及西北省区，另外在东南及华南省区也有少量分布。蒲公英有着清热解毒及利尿散结的功效，因此常被作为中草药和野生蔬菜使用，属药食同源类中药材。药理作用有抗肿瘤、广谱抗菌、免疫调节等,被广泛应用于临床治疗中，如常被用于急性乳腺炎、尿路感染等疾病的治疗[13]。

蒲公英具有很多种的化学成分，主要包括咖啡酸、三萜类黄酮类、酚酸类、倍半萜内酯类、植物甾醇类和香豆素类等化合物[14]。目前已经开发出来的蒲公英药物剂型包括片剂、注射剂等，但在自微乳方面还未有涉足，本试验旨在更加深入地研究利用蒲公英，发挥其最大价值，同时为新剂型的开发提供基础和理论指导。

1 材料与仪器

1.1 材料 咖啡酸标准品(批号：331-39-5),购自北京盛世康普化工技术研究院；咖啡酸，购自湖北鑫鸣泰化学有限公司；1，2-丙二醇、盐酸、甲醇、乙醇，均购自上海凌峰化学试剂有限公司；薄荷油，购自黄山天目薄荷药业有限公司；吐温60、吐温40、吐温80、油酸乙酯、聚乙二醇400，均购自国药集团化学试剂有限公司；其他试剂为分析纯。

1.2 仪器 日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪；LC-20AT泵；LC-solution色谱工作站；ZRS-8G型溶出度测试仪，购自上海书培试验设备有限公司；KQ-250DE型数控超声波清洗器，购自昆山市超声仪器有限公司；TG16MW型台式高速离心机，购自湖南赫西仪器装备有限公司；ZS90型粒度分析仪、恒温磁力加热搅拌器(IKA)、0.45 μm微孔滤膜，均购自天津市津腾实验设备有限公司。

2 方法与结果

2.1 蒲公英根提取物干燥粉末的制备 将75%乙醇回流提取液少量多次加入到蒸发皿里，将蒸发皿放置在烘箱中，调节温度为100 ℃，待蒸发至完全干燥不黏稠时，取出置于室温下，待冷却后用药匙刮下干燥粉末，放置在研钵中研碎后过100目筛，避光干燥保存。

2.2 空白自微乳的处方筛选

2.2.1 药物的溶解度测定 分别称取过量且质量相同的蒲公英根提取物干燥粉末，加入到烧杯里，再分别取1 mL薄荷油、油酸乙酯、油酸加入到其中，在37 ℃恒温水浴下加热10 min，直到不再溶解，再分别测定咖啡酸、总黄酮的含量。

同法测定药物在乳化剂吐温40、吐温60、吐温80中的溶解度，通过观察判断可以得出，药物在其中的溶解度顺序为：吐温80>吐温60>吐温40，同样，药物在助乳化剂即甘油、乙醇、PEG-400、1，2-丙二醇中的溶解度顺序为：1，2-丙二醇>甘油>乙醇>PEG-400。根据药物在各物质中的溶解度可以确定最终自微乳处方的油相为薄荷油，乳化剂为吐温80，助乳化剂为1，2-丙二醇。见表1。

表1 药物在不同油相中的溶解度

2.2.2 伪三元相图的绘制

2.2.2.1 自微乳Km值的确定 设定固定油相与混合表面活性剂的质量比为1∶1，分别按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的质量比例精密称取乳化剂与助乳化剂，放入到干燥洁净的烧杯中，再加入油相，在(37±0.5)℃的恒温水浴中、在转速为500 r/min的条件下进行磁力搅拌，先将自微乳混合均匀，再将水逐滴加入其中。肉眼观察其外观变化，在某一刻能形成澄清透明，或带有少许蓝色乳光的溶液，此时即为形成微乳的临界点，将该点确定为伪三元相图中可形成微乳的区域点(不包含水相边线)，准确记录加水量，计算形成微乳临界点时各组分所占的质量分数[15]，从而绘制伪三元相图。相图的3个顶点分别是油相、混合表面活性剂和水相，用Orign 8.0软件绘制伪三元相图，确定所成微乳区面积，筛选乳化剂和助乳化剂的最佳质量比，即Km值。伪三元相图如图1所示，当乳化剂与助乳化剂比例为5∶5时，即Km值为1时所形成微乳区域的面积最大。以伪三元相图中形成微乳区域的面积和溶液外观作为判断标准，选择最佳乳化剂、助乳化剂的比例，当Km=1时所形成的微乳澄清透明，并带有蓝色乳光，在放置48 h后不分层，其他比例的微乳均有明显分层现象，当乳化剂∶助乳化剂为1∶9时进入凝胶区，呈透明黏稠液体，转子停止转动，不利于在体内自发乳化。见图1。

图1 筛选自微乳给药系统Km值的伪三元相图

2.2.2.2 筛选油相与混合表面活性剂最优比例 固定乳化剂与助乳化剂Km值为1，改变油相所占比例，使其比例分别为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%，混合表面活性剂的比例随之发生相应改变，即乳化剂与助乳化剂均分别为45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%，按“2.2.2.1”项操作，筛选最优比例。其中当油相比例占10%时，加水搅拌后呈黄色油状液体，无变化，不能形成微乳；当油相比例占20%时，加水搅拌后溶液澄清透明且有明显蓝色乳光出现。伪三元相图中形成微乳区域面积表明当薄荷油比例为20%、吐温80比例为40%、1，2-丙二醇比例为40%时为最优处方，外观也呈明显澄清透明且有蓝色乳光的溶液。伪三元相图见图2。

图2 筛选油相与混合表面活性剂最优比例

2.3 星点设计-效应面法优化处方

2.3.1 蒲公英根提取物自微乳的制备 分别按比例精密称取油相、乳化剂和助乳化剂，再称取过量蒲公英根干燥提取物加入其中，在60 ℃恒温水浴中，转速为500 r/min的条件下在磁力搅拌器上进行搅拌，以促进药物在自微乳中的溶解，然后在37 ℃ 恒温水浴中平衡10 min，12 000 r/min离心10 min 后，取上清液即得加药自微乳。

2.3.2 蒲公英根提取物自微乳粒径的测定 称取蒲公英根提取物自微乳至烧杯中，再加入25倍(37±0.5)℃的蒸馏水，在转速为500 r/min的条件下，保持水浴(37±0.5)℃，磁力搅拌均匀后，再用马尔文激光粒度仪测定所形成自微乳的粒径。

2.3.3 蒲公英根提取物自微乳总黄酮载药量的测定 制备加药自微乳，用1 mL移液管精密移取1 mL上清液加入到10 mL容量瓶里，再用浓度为75%的乙醇定容到刻度线处，摇晃均匀后，从其中取出1 mL溶液，进行总黄酮含量的测定。

2.3.4 星点设计-效应面法优化处方 在伪三元相图筛选空白自微乳处方的基础上，选择影响自微乳性质较大的2个因素，将油相质量分数(X1)及Km(X2)作为考察因素，采用伪三元相图法对Km值进行试验，结果显示，当Km=4 时，有较大面积凝胶区域出现，因此Km的范围为1～3；自微乳体系的形成与油相质量分数所占比例有关，当油相所占比例越小，则SMEDDS越容易形成，故将油相质量分数的范围设置在10%～40%。以咖啡酸载药量、总黄酮载药量和粒径为评价指标，采用星点设计-效应面法对处方进行优化[16-17]，因素水平如表2所示，试验设计及结果如表3所示。

表2 星点设计因素水平

表3 星点设计及结果

2.3.4.1 模型拟合 星点设计试验需要对各因素水平进行非线性拟合，即二项式拟合，因此运用Design Expert 8.0.6 软件，做出二项式拟合的模型，其结果分别为：

黄酮载药量(Y1)=-21.105 53+0.810 79A+291.145 65B-0.422 51AB-6.51A2-22.89B2(R=0.975)；

咖啡酸载药量(Y2)=137.238 69+0.672 89A+13.291 435B+107.2 491 235AB-29.489 5A2-46.365 85B2(R=0.949)；

粒径(Y3)=219.781 86+0.754 97A-237.791 47B+0.854 18AB-0.030 482A2+55.252 04B2(R=0.928)。

二项式拟合方程的相关系数分别是0.975、0.949和0.928，相关系数均达到较高值，该设计模型拟合效果良好，结果具有统计学意义，因此可以用该模型对蒲公英根提取物自微乳处方进行分析和预测[18]。

2.3.4.2 效应面优化 采用Design Expert 8.0.6 软件，分别绘制2种不同影响因素对于3个响应值的三维曲线，黄酮载药量的效应曲面如中插彩版图3所示，咖啡酸载药量的效应曲面如中插彩版图4所示，粒径的效应曲面如中插彩版图5所示。根据方程和响应面图确定蒲公英根提取物自微乳的最优处方为：油相比例为35.61%，Km=1.58；黄酮载药量理论值为26.345 8 mg/g，咖啡酸载药量理论值为21.987 9 mg/g，粒径理论值为51.528 7 nm。

2.3.5 验证试验 根据软件优化所得的最佳处方，制备蒲公英根提取物自微乳验证试验，并分别对黄酮、咖啡酸载药量和粒径进行测定，结果见表4。通过验证试验可以证明,最优处方粒径和载药量的真实值与预测值之间存在显著性差异，说明星点设计-效应面法所建立的模型具有预测性良好的特点，可以较好地应用于蒲公英根提取物自微乳给药系统的处方筛选优化。

表4 星点设计-效应面优化法验证

通过对多种不同条件下蒲公英根提取物进行黄酮含量测定，选择黄酮含药量最多的提取液，进一步进行处理，在制备蒲公英根自微乳时使用。油相的筛选中油酸在室温下容易凝固，不符合自微乳油相的要求；乳化剂在筛选时同样吐温40和吐温60在室温条件下容易凝固失去流动性，不利于自微乳的制备，并且溶解度在其中也比在吐温80中小。自微乳的粒径与其在磁力搅拌器上的搅拌时间和转速有关，故试验过程中固定温度、转速和时间等外界条件。通过伪三元相图先初步筛选空白自微乳的比例，在此基础上再利用星点设计-效应面法进一步优化含药自微乳处方，最终由星点设计建立的模型出最优处方。

3 讨论

本试验选择的乳化剂吐温80、吐温60等为非离子型乳化剂，具有高亲水亲油平衡(HLB11-15)值，小肠上皮细胞膜的流动性可被有效改善，增加了细胞间的连接从而加速药物的穿膜渗透，药物的溶出度和生物利用度因此得到提高。处方中助乳化剂则选择能与乳化剂相溶的低相对分子质量的醇类如PEG-400、1，2-丙二醇等，除了可以在其他相之外辅助溶解药物，还可以提高膜的牢固性和界面膜的柔顺性流动性，调节乳化剂的HLB 值，同时又可减少乳化剂的用量，从而降低自微乳的潜在毒性，有利于药物最终的临床应用。与传统乳剂相比，蒲公英根自微乳溶液粒径更小，能够使得药物更加分散，促使药物更快、更有效地被胃肠道吸收，从而提高生物利用度。伪三元相图用于空白自微乳的处方筛选，由于其不完全确定性及试验过程中目测相变临界点的人为因素，故可能存在误差，且处方的覆盖面可能不够全面，因此先确定比例选择各个相的大致范围；再利用星点设计-效应面法进一步对加药自微乳进行处方筛选，此种方法可有效针对试验建立模型，在有效范围内覆盖大面积范围进行试验，相较伪三元相图法筛选处方更加有效准确。

自微乳给药系统可增加难溶性药物的溶解度，口服后其在胃肠蠕动作用下快速乳化和高度分散，形成具有巨大表面积的区域，可有效提高药物的吸收速率和程度；自微乳给药系统中的表面活性剂成分可增加细胞膜的流动性，提高膜的通透性而促进跨膜吸收；自微乳给药系统中脂质成分如脂肪酸等可提高药物的淋巴转运增加口服吸收，具有广泛的应用前景。