混合型猫传染性腹膜炎自然病例的诊断和病理学观察

王金玲，曹 霞，甘 迪，丁玉林，缪增强，杨龙峰，吉林台

(1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018；3.北京市延庆县动物疫病预防控制中心，北京 延庆 102100)

猫传染性腹膜炎(Feline infectious peritonitis,FIP)是由猫冠状病毒引起的一种全世界发生的致死性传染病[1-2]。在猫舍内，猫冠状病毒感染率为100%，但只有5%～10%的感染猫可发展为FIP[3]。近些年，FIP的病例在世界上一直有报道，且发病率有上升趋势。虽然多位国内外研究者报道了FIP的病理变化，但观点不同。为了阐明FIP的特征性病理变化，本试验确诊1例混合型FIP的自然病例，并进行系统的组织病理学观察。

1 材料与方法

1.1 试验动物 1只3岁临床诊断为FIP的病死猫，由呼和浩特某宠物医院赠予。

1.2 尸体剖检及取材 通过问诊猫主人和查阅医师病历记录了解病死猫生前的临床症状。按猫尸检术式进行尸体剖检和大体病变观察，分别取全身各组织器官，大小为1.5 cm×1 cm×0.5 cm左右，固定于10%中性福尔马林溶液中，用于组织病理切片制备。

1.3 组织切片制备和组织病理学观察 固定好的组织进行修块、脱水和透明，石蜡包埋，切片厚度为4 μm，苏木素-伊红(H.E.)染色，制备病理组织切片和进行组织病理学观察。

1.4 病毒的RT-PCR诊断和PCR产物测序

1.4.1 引物 FIP病毒的3′ UTR基因片段的特异引物[4-5]，上游引物为5′-GGCAACCCGATGTTTAAAACTGG-3′；下游引物为5′-CACTAGATCCAG-ACGTTAGCTC-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4.2 病毒RNA的提取 尸检时取病死猫的小肠、脾脏和肝脏，分别提取各组织的总RNA，具体操作步骤按照RnaExTMTotal RNA istolation solution(GK3005,GENERAY BIOTECH)说明书进行。

1.4.3 病毒基因组RNA的扩增 cDNA合成：按PrimeScriptTMRT Master Mix(RR036A,TaKaRa BIO INC.)说明书操作。反应体系(10 μL)：5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL，total RNA 4 μL，RNase Free ddH2O 4 μL。反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，产物4 ℃保存。

PCR反应体系(50 μL)：2×Per Mix 25 μL，dd H2O 19 μL，上下游引物各2 μL，cDNA模板2 μL，轻轻混匀。PCR反应条件：95 ℃ 5 min：95 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，2个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。取5 μL PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳。

1.4.4 PCR产物测序和同源性分析 PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果在GenBank 数据库中进行比对。

2 结果

2.1 临床症状 发病猫为3周岁，逐渐表现精神沉郁，食欲降低，体温39.3 ℃，腹围逐渐增大，触诊腹部腹腔内有大量腹水。发病后期精神极度沉郁，卧地不起，可视黏膜和皮肤明显黄染，经过1个月的治疗，无任何效果而死亡。

2.2 大体病变 病死猫腹围明显膨大，触诊腹壁有明显的波动感。全身各组织器官因严重黄疸而呈黄色。腹部皮肤真皮内表面有较多的大小不等的圆形出血斑点。腹腔内充满淡黄色半透明较黏稠的腹水，腹腔浆膜面弥漫地附着一层薄厚不均的污黄色胶胨样渗出物，大量界限明显的黄白色针尖大小至小米粒大小的结节附着在浆膜面上，一部分结节埋藏在黄色胶胨样渗出物内，一部分结节相互融合成片，腹腔浆膜面凸凹不平(见封三彩版图1,2,3)。局部腹腔浆膜面附着黄色絮状渗出物和散在出血斑点。肝脏肿大，表面呈 “槟榔肝”纹理和散在黑红色小米粒大小的出血斑点。肺脏肿胀，轻度实变，表面湿润有光泽，表面和切面分布弥漫性和融合性的质度较实的暗红色肺炎灶。气管内充满白色泡沫样液体。心肌呈粉白色，心耳外膜散在出血斑点。肾脏肿大，淤血，皮质呈土黄色，无光泽。肠系膜淋巴结肿大，呈黑红色。脑水肿明显。

2.3 组织病理学变化 胃、肠(封三插彩版图4)、肝脏、脾脏(见封三彩版图5)、胰腺、肾脏、肠系膜和膀胱等器官浆膜面均有一厚层浆液纤维素性渗出物附着，渗出物内有大小不一的炎性细胞浸润灶(眼观结节)。浸润灶内主要有大量淋巴细胞、巨噬细胞、浆细胞和少量中性粒细胞，偶见细胞分裂象和少量细胞坏死，较大的浸润灶内和边缘可见少量小血管和成纤维细胞增生。腹腔器官浆膜面间皮细胞增生，体积增大，数量增多，呈多形态向脏器表面增生(见封三彩版图6)。心肌染色变淡，局部心肌纤维间可见淋巴细胞小浸润灶。肝脏明显淤血和水肿，狄氏腔显现，局部有出血灶，肝细胞普遍发生轻度至中度脂肪变性，局部肝被膜下可见大小不等的淋巴细胞浸润灶。肾小管上皮严重肿胀和脂肪变性，局部肾小管上皮细胞坏死，肾间质多见淋巴细胞浸润灶。肺淤血，肺泡间隔增宽，少量淋巴细胞浸润，间质成纤维细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞轻度增生，部分肺泡腔内充满浆液和不同数量的巨噬细胞。胰腺小叶边缘腺泡坏死和间质淋巴细胞增生明显。小肠黏膜严重坏死。小脑浦金野细胞和大脑神经细胞均有明显的变性和坏死，小血管周围出血灶多见。

2.4 RT-PCR结果 从肝脏、脾脏和小肠组织提取的RNA进行RT-PCR，均获得220 bp左右的目的DNA片段(见图7)。

图7 FIP病毒的RT-PCR鉴定

2.5 RT-PCR产物测序结果和同源性分析 RT-PCR产物测序后，从肝脏、脾脏和小肠分别获得相互同源率为100%的220 bp左右的基因序列，在GenBank数据库中进行比对，与Feline coronavirus UU17(序列号:HQ012367)有最高同源性，同源率为99%。

3 讨论

目前，对于FIP的死后确诊主要是通过病理学与病毒抗原检测[6]。FIP有2种类型，分别为湿型(渗漏型)和干型(非渗漏型)[7]。干型FIP特征病变是在组织器官的浆膜面和实质内的结节性病变(肉芽肿)；湿型FIP的特征病变为胸腹腔内大量腹水形成。在兽医临床上，同时表现干型和湿型FIP病理变化的混合型FIP更常见[8]。

该例混合型FIP特征性大体病变为腹腔内充满淡黄色半透明较黏稠的腹水，腹腔浆膜面弥漫地附着大量界限明显的黄白色小米粒大小的结节和一层薄厚不均的污黄色胶胨样渗出物。RT-PCR、测序和基因比对结果表明：所获得的FIP病毒特异性基因片段与Feline coronavirus UU17(序列号HQ012367)有最高同源性(99%)。

目前，针对干型FIP病例浆膜上出现结节的病理组织学国内外研究者观点不同。Kipar A,Weiss R C和Crawford A H等认为结节为肉芽肿性炎和/或化脓性肉芽肿性炎[8-10]，Evermann J F报道结节是由淋巴细胞、巨噬细胞、浆细胞和中性粒细胞所围绕的纤维素坏死性病灶[11]，蒋剑成等报道结节为渗出的脂肪空泡[12]和乔明明等报道结节为肉芽肿病变[5]。在病理学上，肉芽肿是一个组织有序的上皮样细胞(巨噬细胞)聚集性炎灶[13-14]。能引起肉芽肿病变的病因主要为传染性病原(细菌、真菌和寄生虫)和外源性物质(缝线和异物等)。根据病因不同，肉芽肿可能含有淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、多核巨细胞、成纤维细胞和胶原纤维(纤维化)。到炎症后期，传染性病原引起的肉芽肿中央常形成干酪样坏死灶，坏死灶的周围是由上皮细胞和多核巨细胞组成的特殊肉芽组织，肉芽肿的边缘为结缔组织[15]。

通过对本例组织病理学观察，作者认为腹腔浆膜面的结节是伴有浆液-纤维素性渗出的无有序结构的含有大量淋巴细胞、巨噬细胞[16]，浆细胞和少量中性粒细胞浸润的炎性细胞浸润灶，有的炎性细胞浸润灶内伴有轻度的纤维化，而非肉芽肿病变和脂肪空泡。同时，本试验还观察到以肺小叶间质成纤维细胞和Ⅱ型肺上皮细胞轻度增生为特征的间质性肺炎，以淋巴细胞增生和浸润为特征的间质性肝炎、间质性心肌炎、间质性胰腺炎和间质性肾炎。