黄芩汤对小鼠急性肺损伤炎症因子表达的影响

张 鹏，蔺春恒，赵 欣，王 超

(1.沈阳工学院，辽宁 抚顺 113122；2.辽宁农业职业技术学院，辽宁 营口 115009)

近年来临床研究发现，许多化学合成药物的毒副作用较大，这促使我们寻求疗效好、副作用小的药物来治疗炎症。中药有着毒副作用较小和作用范围较广的优点，现在有很多中药成分已被证实具有一定的抗炎作用。黄芩汤首载于《伤寒论》，具有明显的抗菌、抗炎、免疫调节和镇痛作用。临床上多用于痢疾、急性胃肠炎、肠炎、小儿腹泻等症[1]。急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)会引起非心源性肿胀，血氧不足，肺泡腔内被大量炎性细胞浸润，肺泡壁增厚，肺泡毛细血管的通透性增加，转录因子增加，促炎细胞因子和多形核中性粒细胞渗透性分泌显著增多[2]，为研究黄芩汤对急性肺损伤小鼠的保护作用，本试验通过构建脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠体内炎症模型[3]，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、病理切片观察、肺脏干湿重(W/D)测定等方法，探究黄芩汤的体内抗炎作用，以期为开发具有临床应用价值的抗炎中药提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 昆明系雄性小鼠，100只，体重18～22 g，SPF级，购自辽宁省长生生物有限公司。黄芩汤药材，购自北京仟草药业有限公司；LPS(46M4045V)，购自美国Sigma公司；磷酸盐地塞米松(J0912A)，购自大连美仑生物技术有限公司；白介素1β(IL-1β)试剂盒、肿瘤坏死因子α(TNF-α)试剂盒、白介素10(IL-10)试剂盒，均购自美国eBioscience公司；苏木素-伊红染液，购自上海信帆生物科技有限公司；其他试剂，均购自江西平海生物科技有限公司。

1.2 试验分组与饲养管理 100只小鼠饲养3 d环境适应后进行试验，其中40只用来筛选黄芩汤浓度梯度，余下60只小鼠随机分为6组，每组10只，分别为黄芩汤高、中、低3个剂量组、空白对照组、LPS对照组和地塞米松(Dex)对照组，5 d后测量小鼠肺支气管灌洗液(BALF)中TNF-α、IL-1β以及IL-10的含量。每组随机取6只小鼠用于BALF收集和相关指标检测，其余4只右肺用于组织病理切片及苏木精-伊红(H.E.)染色，左肺用于肺W/D测定。

1.3 黄芩汤的制备与稀释 按照《伤寒论》中记载，称取黄芩15 g、芍药10 g、甘草10 g和大枣10 g，用药材总量10倍体积的蒸馏水浸泡1 h后熬制，熬制1 h后过滤药渣，将滤出药渣加8倍体积的蒸馏水继续熬制1 h，将2次药液合并，浓缩为1 g/mL药液。量取黄芩汤适量，加生理盐水稀释定容，稀释倍数分别为640、320、160、80、40、20、10倍和5倍，4 ℃ 保存待用。

1.4 小鼠急性肺损伤模型建立及取样 本试验采用浓度2 mg/(kg·bw)的LPS 10 μL滴鼻建立ALI模型[4-5]，造模6 h后，断颈法处死小鼠，于颈部正中切口5 mm，分离出气管。分3次吸取1.5 mL PBS，反复灌洗3次，取出80 μL的BALF置于-20 ℃保存备用。

1.5 黄芩汤最适稀释倍数筛选 将40只小鼠随机试验共分8组，每组5只，在成功建立小鼠ALI模型后，连续灌喂不同浓度黄芩汤5 d，每次灌胃0.5 mL，第6天处死小鼠取BALF。每组药物稀释倍数分别为640、320、160、80、40、20、10倍和5倍；分别取每组小鼠肺灌洗液，离心后取BALF 800 μL，采用ELISA法检测BALF中TNF-α含量，筛选最佳给药剂量。

1.6 测定指标与方法

1.6.1 肺组织病理切片及H.E.染色 灌喂黄芩汤5 d后，每组4只小鼠断颈处死，不进行灌洗，取右肺叶先放入生理盐水中漂去表面血迹及残留物，用滤纸擦干后立即浸入10%甲醛溶液中固定24 h[6]，通过常规操作进行水洗、脱水、透明、浸蜡、切片、H.E.染色观察其病理学特点。

1.6.2 肺W/D比值 灌喂黄芩汤5 d后，小鼠断颈处死，取左肺上叶称湿重，80 ℃恒温干燥48 h至肺干重恒定，精密称定，计算公式如下：肺W/D比值=肺湿重/干重。

1.6.3 检测炎症细胞因子 试验分组同1.2，不同剂量黄芩汤组小鼠灌喂黄芩汤5 d，第6天处死小鼠取肺灌洗液，每组设2个复孔，采用ELISA试剂盒方法检测上清液中IL-10、TNF-α和IL-1β的含量。收集小鼠BALF，根据IL-10、IL-1β和TNF-α试剂盒说明书检测待测指标。

1.7 试验数据统计与分析 所有数据需要进行统计学分析，使用SPSS Statistics 17.0软件对数据进行一维方差分析，经过分析之后的各组试验数据结果均列入三线表中。

2 结果

2.1 黄芩汤最适稀释倍数筛选 稀释倍数分别为320、160、80、40、20、10倍和5倍的黄芩汤预处理的ALI小鼠的TNF-α含量测定结果见图1。由图1可知，黄芩汤稀释倍数为20、10、5倍时，TNF-α的含量成剂量依赖性，随着药物稀释倍数增加，TNF-α含量明显增加，药物稀释20倍后，随着稀释倍数增加TNF-α含量变化不明显，因此本试验将稀释倍数为5、10、20倍的黄芩汤确定为黄芩汤高、中、低浓度。

图1 黄芩汤对ALI小鼠的最适作用浓度筛选(n=5)

2.2 肺标本H.E.染色 参照Mikawar K等[7]的方法对各组肺组织病理切片进行评级，空白对照组小鼠肺组织形态完整，肺泡壁薄，有极少的炎症细胞浸润，肺泡结构基本完整(中插彩版图2A)；LPS对照组小鼠肺组织结构模糊，肺间质增宽，肺泡腔内可见大量炎症细胞浸润并伴有出血，肺部炎症明显为“+++”级(中插彩版图2B)；黄芩汤高剂量组肺部炎症程度较轻，见少量炎症细胞浸润为“+”级(中插彩版图2C)；黄芩汤中、低剂量组肺部炎症较高剂量组明显可见出血为“++”级(中插彩版图2D，2E)；Dex对照组小鼠肺组织结构基本完整，与空白对照组相似，少见炎症细胞为“-”级(中插彩版图2F)。

2.3 肺湿干重 如表1所示，LPS对照组与空白组比较差异极显著(P<0.01)，说明小鼠急性肺损伤模型构建成功，黄芩汤给药组肺水肿情况具有药物剂量依赖性，且高、中剂量组与模型组比较，具有显著性差异(P<0.05)，因此高、中剂量黄芩汤能够有效减轻小鼠肺水肿。

表1 黄芩汤对急性肺损伤小鼠的肺湿干重影响

2.4 黄芩汤对炎症因子含量的影响 高、中、低浓度的黄芩汤作用于LPS诱导的急性肺损伤小鼠后，TNF-α、IL-1β、IL-10等炎症因子的含量测定结果见表2，黄芩汤高、中、低剂量组不同程度减少TNF-α、IL-1β含量，增加IL-10含量。

表2 黄芩汤对LPS诱导的急性肺损伤小鼠中细胞因子含量的影响

3 讨论

目前，临床上常用抗生素来治疗急性肺损伤等相关疾病[8]。近年来越来越多研究发现，抗生素有不同程度的副作用且易产生耐药性，据报道全球急性肺损伤的病例仍持续上升，给患者及家属带来巨大痛苦。在动物生产方面，呼吸道疾病尤其是下呼吸道疾病，在临床上治疗往往力不从心，随着小动物医疗行业的不断发展，临床上发现越来越多的发病因素可引起急性肺炎，例如常见的波氏杆菌、支原体、流感病毒等，这种炎症的发生大多属于级联反应，如果没有及时治疗，一般预后不良。鉴于目前这种现象，越来越多学者投身于中草药研究，希望从中寻觅良方。

近年来众多学者研究中药单体或者植物提取物对急性肺损伤的影响，据报道苘麻叶[9]、金莲花总黄酮粗提物[10]、金银花提取物[11]对小鼠ALI具有保护作用，这些药物通过调控NF-κB和MAPK两条信号通路，减少下游TNF-α、IL-1β、IL-6的产生，从而达到防治急性肺损伤小鼠的效果。另有学者研究中药单体姜黄素[12]、白藜芦醇[13]、黄藤素[14]、槲皮素[15]时发现，该类药物有提高机体免疫力、抗氧化、抗炎等作用，尤其是防治急性肺损伤小鼠，效果显著。除此之外，还有部分学者研究中药古方或复方对小鼠急性肺损伤的治疗效果。例如麻杏石膏汤能够降低小鼠肺毛细血管通透性并保护毛细血管内膜，提高动脉氧分压，减少炎症因子TNF-α的含量，达到对小鼠急性肺损伤炎症的抑制作用[16]。王雪慧[17]研究发现，通腑汤可以降低小鼠急性肺损伤模型肺灌洗液中重要的前炎性因子TNF-α及促炎因子IL-6的含量，并抑制NF-κB p65 蛋白的表达，进而发挥抗炎效果。本试验结果显示，高剂量黄芩汤组抗炎作用最佳；中、高剂量的黄芩汤能显著地减轻肺水肿程度，极显著地降低小鼠肺灌洗液中TNF-α和IL-1β的含量，且极显著地提高IL-10的含量。试验结果与国内外论文报道基本一致，因此本试验首次发现黄芩汤能显著地影响小鼠急性肺损伤中细胞因子的分泌，抑制炎症的发生、发展。本试验为后期研究抗炎机制提供可靠依据，同时为临床有效防治炎症相关疾病提供参考，为绿色中兽药的研发打下基础。