miR-193a-3p通过HR通路促进食管鳞癌细胞放射抵抗的初步研究

孟 芳，钱立庭，吕 磊

1.无锡市锡山人民医院肿瘤血液科，江苏 无锡 214001； 2.安徽省肿瘤医院肿瘤放疗科；3.安徽省肿瘤医院表观遗传研究室

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞：食管鳞癌细胞系KYSE150、KYSE180、KYSE410、KYSE450由北京国家分子肿瘤重点实验室詹启敏院士惠赠。

1.1.2 主要试剂：RPMI-1640培养基和质量浓度为100 g/L的胎牛血清购自美国Invitrogen公司。mimic、antagomiR、the scramble sequence control (NC)和the ribo FECT CP transfection kit均购自中国广州锐博公司。Rad51抗体(AT3548a)和anti-GAPDH(AM1020a)，辣根过氧化物酶标记的anti-raddit IgG二抗(LP1001b)均购自美国Abgent公司，r-H2AX抗体(P16104)购自UniProt公司，二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)购自Sigma公司。

1.1.3 仪器：6-MV-X射线机器型号CX-SN5340(VARIAN，美国)，美国Thermo Scientific公司8000DH CO2培养箱及酶标仪等。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：KYSE150、KYSE450细胞置于含质量浓度为100 g/L胎牛血清的RPMI-1640培养基与F12培养基(1∶1)，KYSE410、KYSE180细胞置于含质量浓度为100 g/L胎牛血清的RPMI-1640培养基中，于37 ℃、体积分数为5%的CO2条件下培养，2～3 d换液传代1次。取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 实验分组：本实验分为对照组(NC组)和实验组(包括3PM组、3PA组)，3PM组为KYSE150细胞中转染miR-193a-3p mimic，3PA组为KYSE410细胞中转染miR-193a-3p antagomiR。利用6-MV-X射线(CX-SN5340)辐照，X射线源距离样品表面100 mm，能量为6-MV，照射剂量率为300 cGy/min。

1.2.3 MTT实验：根据细胞生长特性，在96孔板中接种细胞，每组细胞设3个复孔，待细胞贴壁后，分别给予0、0.5、1.5、4.5、8、12 Gy(6-MV-X射线)单次吸收剂量照射，根据顾玉明教授等[3]报道，细胞照射处理需再培养5 d，故我们将照射后的细胞放置在37 ℃，体积分数为5%的CO2培养箱中5 d，5 d后向每个孔中加入10 μl MTT(10 mg/ml)，于培养箱中继续培养4 h，吸出培养液，向每个孔中加入150 μl DMSO，震荡充分溶解紫色结晶，酶标仪570 nm处测定吸光度值，算出的值均加上或减去平均值误差，最后算出绘图，此实验重复3次。

(2)计划全面引入BEPS第8项至第10项行动计划成果关于转让定价的定义。转让定价是中国在BEPS成果转化中关注的重点，2015年9月17日，国家税务总局政策法规司发布《特别纳税调整实施办法(征求意见稿)》，对《特别纳税调整实施办法》进行修订，它包含了与无形资产交易相关的全新章节，其中无形资产的规定完全对接了BEPS第8项至第10项行动计划成果相同的宽泛定义，但为适应中国实际情况，某些方面的规定还是与BEPS报告中的意见有差异。

1.2.4 RNA抽提及qRT-PCR：总RNA用TRIzol(Tiangen Biotech公司)抽提剂提取。利用miRNA特异性RT-primer(Ribobio)，采用茎环反转录法使用SYBR Green在FTC-3000P(Funglyn Biotech Inc.，Canada)中定量检测miR-193a-3p及miR-22-3p的表达水平，U6 RNA作为内参。使用2-ΔΔCt方法计算不同组相对水平。

1.2.5 细胞转染：转染miR-193a-3p mimic(3PM)和miR-193a-3p antagomiR(3PA) 50 nm/L，用Lipofectamine 2000转染试剂进行转染。将KYSE150细胞以2×105个/孔，KYSE410细胞以4×105个/孔的密度接种于6孔板培养过夜，待细胞融合度达到50%时，转染24 h后进行RT-PCR实验或48 h后收集蛋白进行Western blotting实验。

1.2.6 细胞增殖实验：KYSE150细胞每孔2 000个，KYSE410细胞每孔4 000个接种于96孔培养板中，5块96孔板，每组设3个复孔，24 h后分别转染，KYSE150中转染miR-193a-3p mimic，KYSE410中转染miR-193a-3p antagomiR，培养24 h后的第1块96孔板最后的平均值为对照，其他依次顺序，最后1块培养板培养96 h，每次均是每孔加入10 μl MTT，继续孵育4 h，弃上清液，每孔加入150 μl DMSO，震荡充分溶解紫色结晶，酶标仪上570 nm测定吸光度值。细胞生长率(%)=[实验组平均值(48 h/72 h/96 h)-空白对照/对照组平均值(24 h)-空白对照]%。

1.2.7 细胞凋亡分析：收集细胞(对照组和实验组)，细胞数为2×106ml-1，800 r/min离心5 min，弃去培养液。用孵育缓冲液洗涤2次，800 r/min离心5 min。用100 μl的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15 min。800 r/min离心5 min，沉淀细胞孵育缓冲液中洗1次。加入荧光(SA-FLOUS)溶液4 ℃下孵育20 min，避光并不时振动。流式细胞术通过流式细胞仪分析，流式细胞仪激发光波长用488 nm，用一波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560 nm的滤器检测PI。结果通过FlowJo7.6.1软件分析。本实验通过3次独立实验完成。

1.2.8 蛋白质印迹法：收集the scramble sequence control(NC)、miR-193a-3p mimic(3PM)和miR-193a-3p antagomiR(3PA)，RIPA蛋白裂解液提取、收集细胞蛋白。每孔5 μl上样量，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel eleetrophoresis，SDS-PAGE)，半干法转至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，质量浓度为50 g/L牛血清白蛋白(BSA)封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜(Rad 51∶1 000，GAPDH 1∶2 000)。PBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的二抗(1∶3 000)，室温孵育2 h。PBST充分洗掉背景后，采用增强ECL底物曝光。目的条带使用chemiluminescence reaction(pierse)显色底物进行显色，相对条带轻度以GAPDH条带为内参，通过Gelgel-Pro Analyzer(media cybernetics)进行测定。

2 结果

2.1 食管鳞癌细胞的放射敏感性分析及miR-193a-3p在4株细胞中的表达如图1A所示，KYSE150细胞在4株细胞中最敏感(4.3 Gy)，KYSE410细胞最耐受(13.9 Gy)，我们采用MTT法检测4株人食管鳞癌细胞(KYSE150、KYSE180、KYSE410、KYSE450)的放射敏感性，相对IC50结果如图1B所示。并在4株细胞中检测了miR-193a-3p的表达，结果发现，miR-193a-3p在4株细胞中的表达量与细胞的敏感性呈负相关(见图1C)，即在敏感株细胞中表达少，而在耐受株细胞中表达相对较多，由此说明miR-193a-3p可能与放射耐受性有关。

注：A：4株食管鳞癌细胞对不同照射剂量的放射敏感性，其中KYSE150最敏感，KYSE410最耐受；B：4株细胞IC50的值；C：miR-193a-3p在4株细胞中的表达水平对比，其中KYSE150表达量最少，KYSE410表达量最多。

2.2 qRT-PCR检测miR-193a-3p在放射敏感株和耐受株中的表达水平从图2可以看出，miR-193a-3p表达量在敏感株中显著低于耐受株(1∶192)。

图2 miR-193a-3p在两株细胞中表达量的差异 Fig 2 Difference expression of miR-193a-3p in two cell lines

2.3 MTT检测miR-193a-3p对食管鳞癌放射敏感性的影响在放射耐受株KYSE410(内源性miR-193a-3p高表达)中转染miR-193a-3p antagomiR(3PA)抑制miR-193a-3p的表达，在放射敏感细胞株KYSE150(内源性miR-193a-3p低表达)中转染miR-193a-3p mimic(3PM)上调miR-193a-3p的表达，经过剂量0、0.5、1.5、4.5、8、12 Gy 6-MV-X射线照射后，与NC组比较，3PA组细胞存活率降低(P<0.05)(见图3A)，3PM组细胞存活率升高(P<0.05)(见图3B)。

2.4 MTT检测miR-193a-3p对食管鳞癌细胞增殖能力的影响如图4所示，与NC组相比，3PM组细胞增殖能力增加，3PA组细胞增殖能力明显下降。由此得出，miR-193a-3p与食管鳞癌细胞的增殖能力呈正相关。

2.5 流式细胞术分析miR-193a-3p对食管鳞癌细胞凋亡的影响采用流式分析法检测miR-193a-3p对食管鳞癌细胞凋亡的影响，与NC组相比，3PM组细胞凋亡率下降11.10%(见图5A)；3PA组细胞凋亡率增加3.63%(见图5B)，此结果表明，miR-193a-3p抑制食管鳞癌细胞凋亡，结合MTT实验的数据表明，miR-193a-3p有辐射抑制的效果。

A：在KYSE410细胞株中抑制miR-193a-3p的表达水平，该株细胞的放射敏感性增加；B：在KYSE150细胞株中增加miR-193a-3p的表达水平，该株细胞的放射敏感性下降。

2.6 检测miR-193a-3p不同水平对r-H2AX及RAD51的影响为了验证miR-193a-3p是否通过影响DNA双链修复促进放射耐受性，我们通过Western blotting检测细胞辐照18 h后r-H2AX及RAD51的表达，结果证明，在KYSE150中转染miR-193a-3p mimic可以促进r-H2AX蛋白表达(1.00∶1.25)，抑制RAD51蛋白表达(1.00∶0.63)，而在KYSE410中转染miR-193a-3p antagomiR则可以抑制r-H2AX蛋白表达(1.00∶0.85)，促进RAD51的表达(1.00∶1.55)，这一结果表明，miR-193a-3p可能通过ATM/HR通路促进DNA双链断裂后的修复(见图6)。

注：A：低表达miR-193a-3p，细胞凋亡率增加；B：高表达miR-193a-3p，细胞凋亡率下降。

图6 高表达或低表达miR-193a-3p对RAD51和r-H2AX蛋白表达的影响Fig 6 The effect of high or low expression of miR-193a-3p on the protein expressions of RAD51 and r-H2AX

3 讨论

目前我们对于肿瘤放射耐受的机制已有一定的认识，除了DNA damage repair等[4]经典机制外，其中非编码RNA尤其是miRNA对于肿瘤放射治疗的影响在近些年来引起了越来越多人的关注，有文献报道,miRNA可促进食管鳞癌细胞的放射抵抗性[5]，miRNA是真核生物中广泛存在的一种长21～23个核苷酸的RNA分子，可以通过与特定蛋白编码基因的mRNA 3′-UTR区的RNA发生序列特异性结合，继而抑制翻译或引起mRNA降解，导致这些蛋白编码基因的表达下调[6]。我们前期研究发现，miR-193a-3p通过调控其下游基因早老素1重组蛋白(presenilin1,PSEN1)/赖氨酰氧化酶样蛋白4(lysyl oxidase-like 4,LOXL4)促进食管鳞癌细胞抗放射性[7-8]。

miRNA影响放射耐受性的机制是多样和复杂的，Zhou等研究报道，miR-381通过下调其靶基因影响食管癌放射耐受性[9]，Yan等表明，miR-24通过调控FERMT1影响食管癌放射耐受性[10]，Zheng等研究表明，miRNA-200c通过调控P21影响食管癌细胞的放射耐受性[11]，本研究对细胞凋亡变化进行了检测，结果发现，与NC组相比，3PM组细胞凋亡率下降11.10%，3PA组细胞凋亡率增加3.63%,以上数据说明miR-193a-3p抑制食管鳞癌细胞凋亡，我们知道细胞的放射抵抗性受很多因素影响，但其中最重要的影响因素是DNA双链断裂后的修复能力，组蛋白2A变异体(H2AX)是DNA双链断裂后修复的重要蛋白，它是细胞照射后较早出现修复DNA双链的蛋白，其在DNA双链断裂损伤可发生不同翻译修饰促进局部DNA修复，其主要通过ATM介导DNA双链断裂形成时磷酸化，是衡量DNA损伤程度的重要指标[12]。通过Western blotting验证发现，miR-193a-3p可能通过促进食管癌细胞DNA双链断裂修复来增加放射抵抗性，为了更进一步了解miR-193a-3p影响DNA双链断裂修复的分子机制，我们对此研究了HR通路，HR通路即同源重组修复通路，它的分子机制最早在细菌和酵母中阐明，在哺乳动物中保守，它的主要过程有DNA损伤位点的加工处理，链侵入和修复性合成等，而HR修复的关键步骤是RAD51依赖性链侵入性过程，RAD51是HR通路的关键蛋白和修复HR通路的核心分子[13]，由此我们检测了改变miR-193a-3p水平后对RAD51表达水平的影响，结果表明，上调miR-193a-3p并辐射18 h后，RAD51蛋白表达增加(1.00∶1.55)，抑制miR-193a-3p表达，RAD51蛋白表达减少(1.00∶0.63)，并有文献表明，过表达RAD51可以增加哺乳动物细胞的放射抵抗性[14]，故认为miR-193a-3p影响食管癌放射耐受性可能与HR通路有关，所以我们得出miR-193a-3p是通过影响食管癌细胞DNA双链断裂修复能力，从而促进食管癌细胞放射耐受性，但ATM的其他下游底物如MEC1[15]，HR通路的其他蛋白如HP1、SUV39H1/2[16]未进行研究，miR-193a-3p是否还会通过这些基因影响放射耐受性仍值得进一步探索。

总之，miR-193a-3p可能是食管癌放疗耐受的一个潜在标志物，其促进DNA双链断裂修复可能是其促进放射耐受性的一个机制，而miR-193a-3p是否通过其他机制参与耐受，还需要进一步探索。