KIFC3在结肠癌中的表达及其对结肠癌细胞迁移和侵袭的影响

张 岚，董卫国

武汉大学人民医院消化内科，湖北 武汉 430060

结肠癌作为世界上第三大最常见的恶性肿瘤，对社会造成巨大的经济负担。尽管现代诊疗技术取得长足进步，但对于已经发生转移的患者，往往治疗效果欠佳[1-2]。驱动蛋白超家族(kinesin superfamily，KIFs)在人体中由45个家族成员组成，在肿瘤的发生、发展过程中发挥着不同的作用[3]。KIF21B参与非小细胞肺癌细胞迁移和侵袭，抑制KIF21B表达可显著抑制裸鼠移植瘤生长[4]；KIF2A与KIF20A在多种癌症中表达上调，且与肿瘤患者发生淋巴结转移和远处转移密切相关[5]。KIF23、KIF20B及KIF15分别能够通过刺激癌细胞增殖进而促进胃癌、肾透明细胞癌、舌癌和骨肉瘤进展[6-9]。然而，关于KIFC3在结肠癌中的表达及作用研究尚不足。本研究通过生物信息学方法对多种公共数据库进行分析，探索KIFC3在结肠癌组织中的表达情况及其对结肠癌患者预后的影响，并分析KIFC3对结肠癌细胞迁移和侵袭的影响，为基础和临床研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂结肠癌细胞系SW480、DLD-1、HT29与HCT116和正常结肠上皮细胞NCM460由武汉大学人民医院中心实验室提供，DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司，KIFC3慢病毒感染液购自上海吉凯基因。Matrigel胶购自Invitrogen公司，Transwell小室购自Corning公司。KIFC3(10125-2-AP)、MMP2(10373-2-AP)、MMP9(10375-2-AP)、E-cadherin(20874-1-AP)、Snail(13099-1-AP)及GAPDH(10494-1-AP)抗体购自Proteintech公司。

1.2 细胞转染实验取对数生长期的细胞，使用胰酶消化后收集并接种在6孔板中，接种密度为5×104个/ml，于37 ℃和体积分数为5%的CO2培养箱中培养过夜。根据说明书的步骤，用干扰KIFC3基因的慢病毒感染SW480细胞，病毒载体为GV248，元件顺序为hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin，克隆位点为AgeI/EcoRI，MOI与病毒滴度分别为100和2×109TU/ml，干扰序列与对照序列分别为CGCTCTATTCCCTCAAGTT和TTCTCCGAACGTGTCACGT，48 h后收集细胞并用于后续实验。实验分组为阴性对照组即NC组和干扰KIFC3表达组即sh-KIFC3组。

1.3 GEPIA与UALCAN数据库在GEPIA数据库基因栏输入KIFC1/2/3，肿瘤样本选择食管癌、胃癌和结肠癌，分析KIFC1/2/3在肿瘤组织和正常组织中的差异表达和KIFC1/2/3表达水平与食管癌、胃癌和结肠癌患者总生存时间(overall survival，OS)、无病生存时间(disease free survival，DFS)的关系。在UALCAN数据库基因栏输入KIFC3，肿瘤样本选择结肠癌，分析KIFC3基于结肠癌分期、分型和淋巴结转移的差异表达情况。

1.4 GO分析与KEGG富集分析在STRING数据库基因栏输入KIFC3，搜索与KIFC3存在共表达或相互作用的基因，建立蛋白互作网络(protein-protein interaction，PPI)。在Cytoscape软件中运用ClueGO插件对上述基因作GO分析与KEGG富集分析。

1.5 TIMER数据库在TIMER数据库基因栏输入KIFC3，肿瘤样本选择结肠癌，分析KIFC3表达水平与常见细胞增殖、周期、迁移和侵袭分子标志物表达量的关系。

1.6 细胞迁移、侵袭实验细胞迁移：胰酶消化细胞后收集并接种于6孔板中，待细胞长满后丢弃培养基，用20 μl枪头比着直尺在6孔板底部划痕，PBS清洗3次弃去漂浮的细胞。加入2 ml无血清培养基后于培养箱培养，分别于培养后0、12、24、48 h观察细胞迁移情况，并拍照。

细胞侵袭：将结肠癌细胞接种于载有Transwell小室的24孔板中，小室底部铺有一层Matrigel胶。小室上室含有100 μl细胞悬液，下室中加入500 μl含质量浓度为100 g/L胎牛血清的DMEM培养基。培养箱中培养24 h后，用棉签擦除上室的基质胶和细胞。多聚甲醛固定后，结晶紫染色，显微镜观察并拍照。

1.7 Western blotting实验RIPA裂解液冰上裂解细胞后提取蛋白，根据BCA试剂盒测定蛋白浓度。每孔50 μg行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜至PVDF膜后，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，4 ℃一抗孵育过夜，二抗室温孵育1 h，Odyssey显像并分析。

2 结果

2.1 KIFC1/2/3在消化道肿瘤中的表达通过GEPIA数据库分析KIFC1/2/3在食管癌、胃癌和结肠癌组织中的表达情况，结果显示，相比正常组织，KIFC1/2/3在肿瘤组织中的表达量均明显增加(见图1A)。Western blotting结果表明，相比NCM460细胞，结肠癌细胞系SW480、DLD-1、HT29与HCT116中KIFC3均表达上调(见图1B～1C)。

2.2 KIFC3表达与结肠癌预后的关系通过GEPIA数据库分析KIFC1/2/3对食管癌、胃癌和结肠癌患者预后的影响，结果显示，KIFC3高表达影响结肠癌患者总生存期，但对无病生存期的影响差异无统计学意义；KIFC1和KIFC2对3种肿瘤患者生存时间的影响差异均无统计学意义(P>0.05)(见图2)。由于KIFC1与KIFC2对3种消化道肿瘤的预后均无影响，因此本研究主要探讨KIFC3在结肠癌组织中的表达及其对结肠癌细胞迁移和侵袭的影响。

注：*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001。

图2 KIFC3表达与结肠癌预后的关系Fig 2 Relationship between KIFC3 expression and prognosis of colon cancer

2.3 KIFC3与结肠癌临床特征相关性分析通过UALCAN数据库分析KIFC3与结肠癌临床特征的相关性，结果表明，KIFC3高表达与结肠癌分期和淋巴结转移相关。此外，相比于结肠腺癌，结肠黏液性腺癌中KIFC3表达量更高(见图3)。

2.4 KIFC3共表达与基因富集分析通过STRING数据库分析与KIFC3存在相互作用或共表达的基因，结果显示，KIFC3与CTNND1、CDH1、PRC1等基因存在相互作用或共表达。进一步利用Cytoscape软件进行GO分析与KEGG富集分析，结果表明，KIFC3可能参与细胞间黏附和紧密连接的过程(见图4)。

注：*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001。

图4 KIFC3共表达基因及基因富集分析Fig 4 Coexpression gene and gene enrichment analysis of KIFC3

2.5 KIFC3与MMP2、MMP9表达的关系为了进一步验证上述富集分析结果，我们利用TIMER数据库分析KIFC3与常见细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭相关分子标志物表达量的关系。结果表明，KIFC3与MMP2和MMP9呈显著正相关(见图5)。

2.6 KIFC3对结肠癌细胞迁移和侵袭的影响细胞划痕实验与Transwell细胞侵袭实验检测KIFC3对结肠癌细胞SW480迁移与侵袭能力的影响。实验结果表明，与NC组相比，sh-KIFC3组SW480细胞迁移、侵袭能力显著下降。Western blotting结果显示，sh-KIFC3组KIFC3、MMP2、MMP9和Snail蛋白表达下调，E-cadherin蛋白表达上调(见图6)。

3 讨论

肿瘤细胞的侵袭和转移与患者的不良预后密切相关，寻找有效的治疗靶点、扼制肿瘤细胞的侵袭和转移，进而抑制肿瘤的发展是改善肿瘤患者预后的重要手段。驱动蛋白家族作为细胞内的一类马达蛋白，主要参与细胞内物质运输过程。驱动蛋白通过水解ATP获取能量并驱动自身及所携带的货物分子沿微管运动[10]。此外，在有丝分裂过程中，驱动蛋白也是染色体和纺锤体分离的重要参与者[11]。研究发现，过表达驱动蛋白家族成员(KIF1A、KIF5A、KIFC1和KIFC3)，

图5 KIFC3与常见细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭相关分子标志物的关系Fig 5 Relationship between KIFC3 and common molecular markers of cell proliferation, apoptosis, migration and invasion

注：*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001。

乳腺癌细胞对多西他赛、紫杉醇耐药性增强[12-13]，驱动蛋白抑制剂的开发有望提高乳腺癌化疗的效果。KIFC3还被发现与肝细胞癌患者的不良预后有关，KIFC3高表达提示更短的生存时间，且KIFC3与肝细胞癌迁移和侵袭相关[14]。可见，KIFC3在部分肿瘤中可能扮演着癌基因的角色，抑制其表达有望降低肿瘤细胞转移和耐药。

本次研究利用GEPIA数据库分析食管癌、胃癌和结肠癌组织与相应正常组织中KIFC1/2/3的表达情况，结果表明，相比于正常组织，KIFC1/2/3在肿瘤组织中呈高表达，且KIFC3高表达结肠癌患者的生存时间更短，提示KIFC3的高表达可能与结肠癌的发生、发展相关。为了探索KIFC3对结肠癌生物学行为的影响，我们进一步利用STRING数据库分析与KIFC3相互作用或存在共表达现象的其他分子，并对相关分子做GO分析与KEGG富集分析。分析结果显示，KIFC3可能影响细胞间黏附与紧密连接，这提示KIFC3对肿瘤细胞迁移和侵袭可能存在一定的作用。TIMER数据库结果显示，KIFC3与几种常见细胞增殖和周期分子无相关性，但与MMP2和MMP9相关性显著。MMP2与MMP9均为基质金属蛋白酶家族成员，当被细胞外蛋白酶分解后发生激活，分解细胞外基质，参与肿瘤细胞的迁移和侵袭[15]。这与基因富集分析结果存在一致性，即KIFC3对肿瘤细胞转移的潜在影响。EMT在结肠癌转移过程中具有重要意义。EMT使得肿瘤细胞与基底膜和其他细胞之间的连接不再紧密，为肿瘤细胞进入循环系统播散至全身其他器官提供便利[16]。血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶2(serum and glucocorticoid-inducible kinase 2，SGK2)在结肠癌中过表达，与EMT呈正相关[17]。天然化合物鱼藤酮能够抑制EMT，扼制结肠癌细胞增殖和迁移[18]。在本研究中，通过慢病毒干扰KIFC3表达，我们发现KIFC3能够促进结肠癌细胞迁移与侵袭，且可能通过促进EMT实现。本次研究也存在一定的局限性，由于缺乏临床结肠癌组织与癌旁组织样本，KIFC3差异表达仅在细胞层面得到验证，而其在结肠癌组织与癌旁组织的差异表达主要通过挖掘公共数据库获得。

总之，本次研究结果表明，KIFC3在结肠癌组织与细胞中高表达，可能通过促进EMT刺激结肠癌细胞的侵袭和迁移，影响结肠癌患者生存时间，有可能成为结肠癌治疗的新靶点。