疫霉菌有性生殖检测体系的建立

朱香园

（长治市农产品质量安全检验监测中心，山西 长治 046000）

疫霉菌属于藻界（Chromista），卵菌门（Oomycota），鞭毛菌亚门（Mastigomycotina），卵菌纲（Ommycetes），霜霉目（Peronosporales），腐霉科（Pyhiaceae），具有无性生殖和有性生殖两种生殖方式[1]。马铃薯晚疫病就是该菌导致的，严重的可导致一个地区的马铃薯绝收[2]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌柱。本研究所用的马铃薯晚疫病菌—致病疫霉：BDTX5—1（A1）和HQK8—3（A2）。

1.1.2 供试培养基。黑麦—番茄培养基：900ml黑麦汁，100ml含0.4%CaCO3的番茄汁，琼脂粉15g；燕麦—番茄培养基：900ml燕麦汁，100ml含0.4%CaCO3的番茄汁，琼脂粉15g；以上培养基均是在121℃高压下灭菌15min。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的选择。同时制备燕麦—番茄培养基和黑麦—番茄培养基平板，然后将同一种菌种在同一时间点分别接种在这两种培养基平板上，放于18℃的黑暗环境中培养，第三天的时候开始观察不同培养基上菌落的生长状态。并拍照。

1.2.2 致病疫霉A1和A2交配型菌株间卵孢子的产生。首先制备黑麦—番茄平板（9cm的培养皿）。分别将A1交配型和A2交配型的菌丝块5mm×5mm×3mm，同时接种到同一平板上，两个菌丝块距平板中心约1.5cm，待两个交配型的菌丝长的刚接触到时在显微镜下观察是否有卵孢子产生。

1.2.3 致病疫霉纸盘法有性生殖检测体系的建立。①制备1000ml 1970 V8 黑麦培养液分装到2个三角瓶中，每瓶500mL，121℃高压灭菌15min后，冷却至室温。②将A1交配型的14块5mm×5mm×3mm菌丝块和A2交配型菌丝块1块接种到500mL的培养液里，黑暗培养17d（20℃，80rpm）。作为实验组。③对照组的设置，将15块5mm×5mm×3mm 的A2交配型菌丝块接种到另一500ml的培养液里。以和实验组同样的条件进行培养。④17d后用定性滤纸将培养液中的菌丝体滤出，取出5 mL滤液过滤除菌后冷冻保存。其他培养液于旋转蒸发仪上浓缩到5～10ml。将以上所得的虑液在置于冷冻干燥器中，进行冷冻干燥将最终得到粉末称重。⑤用10 mL无菌水将得到的A1和A2两个交配型粉末分别溶解，然后进行过滤除菌后分装冻存。⑥将一块A2交配型的5×5×3mm菌丝块置于培养基中央（9cm的培养皿），18℃黑暗培养约10d。将第5步所得的液体滴在无菌滤纸片（Ф7mm）上，将滤纸片放于距培养皿中心约1.5cm的位置处（此时疫霉菌克隆的直径约为40mm）培养7d，显微镜下观察滤纸片覆盖部位的卵孢子并计数。一个培养皿上可以放置6个滤纸片，设计成浓度梯度。其中一个是A2的浓缩培养液50μL，另外5个是A1的：一个为A1的最初培养液，其它四个为A1培养液浓缩后的液体，一个为浓缩液50μL，一个30 μL，一个20μL，一个10μL，不足50μL的体系用空白培养液补平）。该实验做3个重复。⑦滤纸片放好后，在18℃黑暗条件下培养7天，显微镜下观察滤纸片覆盖部位的卵孢子并计数。

2 结果与分析

2.1 致病疫霉培养基的选择

以致病疫霉A2交配型菌株为代表，筛选适合的培养基。将A2交配型菌株分别接种在黑麦—番茄和燕麦—番茄培养基上，观察其生长情况。燕麦—番茄培养基上生长的A2交配型菌落要比黑麦—番茄上的小。因此，黑麦—番茄培养基应该更适合致病疫霉的生长。

2.2 致病疫霉A1和A2交配型菌株间卵孢子的产生

分别把A1和A2交配型菌株接种在同一块培养基上，黑暗培养天，显微镜观察交界面处卵孢子的产生情况。这两株致病疫霉菌株可以通过菌株间的有性生殖产生卵孢子，可用于后续的实验。

2.3 致病疫霉纸盘法有性生殖检测体系的建立

三个重复中蘸有50 μL的A2浓缩培养液的滤纸片处均未产生卵孢子。同时也可以明显看到随着A1培养液浓度的增大，三个重复中每个滤纸片处的卵孢子数目也随着增加。说明A1浓缩培养液中含有α1性激素，且其含量能够诱导A2交配型菌株产生合适数量的卵孢子，可以用于未来的有性生殖检测。

3 结论与讨论

3.1 结论

本研究主要是对疫霉菌的有性生殖检测体系进行建立。结果表明，用浓缩的A1交配型菌株培养液可以有效诱导A2交配型菌株进行有性生殖并产生合适数量的卵孢子，说明纸盘法有性生殖检测体系基本建立。

3.2 讨论

A1和A2两个交配型菌株单独培养时都不能产生卵孢子，只会产生近梨形的孢子囊。当将A1和A2两个交配型菌株接种在同一培养平板上，培养一段时间后发现两个交配型菌株交界处有卵孢子产生，说明两个菌株间可以进行有性生殖，本实验所用的A1和A2两个交配型菌株可用于进一步的实验。

接下来我们尝试利用浓缩的疫霉菌培养液建立疫霉菌纸盘法有性生殖检测体系。实验结果表明，不同量的A1交配型菌株的浓缩培养液都会诱导A2交配型菌株产生卵孢子，只是随着浓缩培养液的量的减少产生的卵孢子的数量也在减少。