大柴胡汤及其拆方对非酒精性脂肪肝病(NAFLD)大鼠模型“肝-肠轴”影响的形态学

高誉珊 张鑫蕾 吴梦瑶 周璐 张淑静 陈琳 王敏 孙燕 郑丰杰 李宇航

摘要 目的：观察大柴胡汤及其拆方（方剂要素）对非酒精性脂肪肝病（NAFLD）大鼠模型“肝-肠轴”肝、肠形态学的影响。方法：采用随机数字表法将大鼠随机分为正常组、模型组、盐酸吡格列酮组、大柴胡汤组、疏肝利胆组、健脾化痰组、通腑泄浊组。采用高脂高糖饲料喂养16周建立NAFLD模型，并于第13～16周分别给予大柴胡汤及拆方。造模结束后，取小肠组织，电镜观察细胞间紧密连接情况，采用HE染色、油红O染色、Masson染色观察各组大鼠肝组织。结果：模型组肠细胞间隙明显增大，紧密连接程度降低，各给药组细胞间隙均有不同程度地减小，以全方组最为显著;正常组大鼠肝细胞结构正常，模型组大鼠部分肝细胞呈气球样变性，见不同程度脂滴形成，各给药组较模型组脂滴情况均有不同程度减轻。结论：大柴胡汤及其拆方均能不同程度地改善NAFLD模型大鼠肝细胞脂肪变及肠细胞紧密连接情况，并以全方共用效果尤著，疏肝利胆、健脾化痰、通腑泄浊等治法联合运用对改善NAFLD具有较好的疗效。

关键词 大柴胡汤;方剂要素;拆方研究;非酒精性脂肪性肝病;肝-肠轴;形态学;电镜;油红O染色

Abstract Objective：To observe the effect of Dachaihu Decoction（DD）and its decomposition（formula-factors）on liver and intestine morphology of non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）model rats.Methods：Rats were divided into a normal group，a model group，a pioglitazone hydrochloride group，a DD group，a Shugan Lidan group，a Jianpi huatan group and a Tongfu Xiezhuo group by random number table.NAFLD model was established by feeding high-fat and high-sugar diet for 16 weeks，and DD and decomposition were given at 13-16 weeks respectively.After modeling，small intestinal tissues were taken and tight junctions between cells were observed by electron microscopy.Liver tissues of rats in each group were observed by HE，oil red O and Masson staining.Results：The intestinal intercellular space of the model group increased significantly and the degree of tight junction decreased，the intercellular space of each drug group decreased，especially in the DD group.The structure of hepatocytes in the normal group was normal，some hepatocytes in the model group showed balloon-like degeneration，and lipid droplets were formed in varying degrees.The lipid droplets in each drug group were alleviated to compare with the model group.Conclusion：DD and its decomposition can improve the fatty degeneration of hepatocytes and the tight junctions of intestinal cells in NAFLD model rats to varying degrees，and the effect of all prescriptions is particularly effective.The combined use of treatments such as soothing the liver and promoting gallbladder，invigorating the spleen and removing phlegm，and clearing the fu organs can improve NAFLD with good effect.

Keywords Dachaihu Decoction; Formula-factors; Research on decomposition; Non-alcoholic fatty liver disease; Liver-intestinal axis; Morphology; Electron microscope; Oil red O staining

中圖分类号：R289.4文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.21.012

非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）是指除外酒精和其他明确损肝因素所导致的以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，是与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝脏损伤。目前临床主要推荐使用吡格列酮等胰岛素增敏剂进行治疗[1]。近年来随着“肝-肠轴”概念的提出，肝病的发生与肠黏膜屏障的关系逐渐受到关注。研究表明，肠黏膜屏障功能受损，致使肠黏膜通透性改变，会导致肠道内细菌及其产物（如内毒素等）移位至肠外的肝组织，引起其免疫系统异常活化和炎性反应，从而诱导NAFLD的发生发展[2-3]。

中医学根据NAFLD“脾失健运、肝失疏泄、痰浊内生、湿热内蕴、瘀血阻滞”的主要病机，采用调理肝脾、祛痰化瘀、利湿泄浊等治法进行治疗，取得较好疗效[4-10]。然而，针对NAFLD所使用的中医复方中，药物之间的作用较为复杂，方剂要素的作用靶点及不同方剂要素间发生协同作用的机制仍未明确。为此，本实验选取大柴胡汤及其拆方（方剂要素）为主要干预手段，以NAFLD大鼠模型为干预对象，主要从肠、肝的形态学角度对具有疏肝利胆、健脾化痰、通腑泄浊之效的大柴胡汤及其拆方作用效果进行探讨，以期为中医临床治疗NAFLD时更为明确地选择相应治法提供基础实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

SPF级SD雄性大鼠105只，体质量（180±20）g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0002。大鼠于SPF级动物房内饲养，室温为22 ℃，湿度为50%。适应性喂养7 d以后开始造模，整过程自由进食、饮水。

1.1.2 药物

中药材购自北京同仁堂医药药材有限公司，经北京中医药大学中药鉴定研究室鉴定;盐酸吡格列酮片购于京东大药房（中美华东制药，产品批号：170102）。

1.1.3 试剂与仪器 苏木素（北京索莱宝科技有限公司，货号：G1140-500）;伊红（北京索莱宝科技有限公司，货号：G1100-500）;无水乙醇（北京化工厂，货号：BH100535）;0.9%生理盐水（双鹤药业，货号：PB30164）;二甲苯（北京化工厂，货号：1929462024）;中性树胶（北化试剂，货号：N861409）;饱和油红O染液（北京索莱宝科技有限公司，货号：G1260-100）。移液器[Eppendorf艾本德（中国），型号：Reference];电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，型号：AL204];生物组织包埋机（金华市益迪医疗设备有限公司，型号：YD-6L）;电热恒温培养箱（天津市中环实验电炉有限公司，型号：DH-1000）;电热鼓风干燥箱（上海-恒科学仪器有限公司，型号：PH-101A）;珊顿全自动切片机[Thermo赛默飞（中国），型号：HM-325];照相显微镜[Olympus奥林巴斯（中国），型号：BX53]。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

根据以往研究提出的“方-证要素对应”组方规律[11]，将大柴胡汤按照所对应的“证候要素”，拆方分成以下3个“方剂要素”，即与“肝胆疏泄失职”证候要素相对应的疏肝利胆药组，其方剂要素为柴胡、黄芩、芍药;与“脾虚痰湿中阻”证候要素相对应的健脾化痰药组，其方剂要素为半夏、生姜、大枣;与“大肠浊热”证候要素相对应的通腑泄浊药组，其方剂要素为大黄、枳实。

按随机数字表法随机分为正常组、模型组、盐酸吡格列酮组、疏肝利胆组、健脾化痰组、通腑泄浊组、大柴胡汤组7组，每组15只，于SPF级动物房内饲养。

根据文献[9]及预实验验证，选定高脂高糖饲料配方为：52.5%维持饲料+30%蔗糖+10%猪油+2%胆固醇+5%蛋黄粉+0.5%胆酸钠。适应性喂养7 d后，正常组予以维持饲料喂养，其余组均予以高脂高糖饲料自由采食16周，以期建立NAFLD模型。造模结果判定：采用美国国立卫生研究院NASH临床研究网络病理工作委员会2005年制定的指南（表1），进行NAFLD活动度积分（NAFLD Activity Score，NAS）评分，其中NAS>5分者明确诊断为非酒精性脂肪性肝炎（NASH），NAS<3分可排除NASH。

1.2.2 干预方法

盐酸吡格列酮片参照文献[10]予以10 mg/（kg·d）制成懸浊剂。大柴胡汤（柴胡15 g、黄芩9 g、白芍9 g、法半夏9 g、生姜15 g、大枣12 g、生大黄6 g、烫枳实9 g）剂量参照《方剂学》教材[12]，并按照体表面积法换算求得大鼠单位体质量生药量8.64 g/kg[13]：疏肝利胆组（柴胡15 g、黄芩9 g、白芍9 g）3.39 g/kg;健脾化痰组（法半夏9 g、生姜15 g、大枣12 g）3.70 g/kg;通腑泄浊组（生大黄6 g、烫枳实9 g）1.54 g/kg。第13～16周，分别给予各实验组大鼠相应药液灌胃，3 mL/只，1次/d，正常组、模型组同时予以等量蒸馏水。

1.2.3 检测指标与方法

第16周末次灌胃后，禁食12 h后取材，称量肝脏湿重。取肝组织及肠组织进行冰冻切片、石蜡切片及超薄切片。使用石蜡切片进行HE染色及Masson染色，冰冻切片进行油红O染色，超薄切片观察肠组织细胞间隙情况。其中，肝脏脂滴空泡状面积率的计算使用图像处理软件Image pro plus 6.0（Media Cybernetics，美国）对各组油红O染色的肝脏脂滴空泡状面积率进行计算，公式为：肝脏脂滴空泡状面积率=100×脂滴空泡状面积/图片总面积，噪声点的过滤阈值为200，以3×3的像素进行面积计算，H：0～20[14]。

1.3 统计学方法

采用IBM SPSS 20.0统计软件对各组间的差异进行统计学分析，各组肠组织细胞间隙的宽度与肝脏脂滴空泡状面积率数据等计量资料以均值±标准差（±s）表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察

正常组大鼠肝脏外观形态正常，呈红褐色，表面光滑有光泽，边缘锐利、质地韧;模型组大鼠肝脏体积明显增大，呈黄褐色，表面粗糙，包膜紧张，边缘变钝，质地较软，切面有油腻感;盐酸吡格列酮组大鼠肝脏呈红黄相间，边缘较锐利，质地偏软;疏肝利胆组、健脾化痰组、通腑泄浊组及大柴胡汤组大鼠肝脏呈浅黄色，表面较模型组细腻，稍有包膜紧张，边缘稍钝，质地偏软。

2.2 光镜观察

2.2.1 肝组织HE染色

如图1所示，正常组大鼠肝小叶结构完整、清晰，汇管区界线清楚，肝细胞结构正常，肝细胞以中央静脉为中心向周围呈放射状分布，肝窦清晰可见;模型组大鼠肝细胞肿胀，部分细胞呈气球样变，细胞核被挤向一边，多数肝细胞内可见大小不等、数量不一的脂滴空泡，肝索排列紊乱;盐酸吡格列酮组大鼠呈轻度脂肪变，部分细胞内可见细小脂滴空泡，肝索排列较乱;疏肝利胆组、健脾化痰组、通腑泄浊组大鼠肝组织均可见不同程度弥漫性肝细胞脂肪变，但脂肪变程度较模型组呈不同程度减少;大柴胡汤组大鼠肝细胞弥漫性脂肪变较模型组显著改善，部分细胞结构正常，远离中央静脉细胞可见小泡型脂滴空泡，肝索排列紊乱。

2.2.2 肝组织油红O染色

如图2所示，正常组大鼠肝组织中无染色脂滴;模型组大鼠肝细胞内脂滴呈弥漫性、颗粒状堆积，融合成片状;盐酸吡格列酮组、疏肝利胆组、健脾化痰组、通腑泄浊组、大柴胡汤组大鼠肝细胞脂滴数量均较明显减少，较为稀疏，脂滴体积相对较小，呈小颗粒状不均匀分布。表2为肝脏脂滴空泡状面积率统计结果。结果显示全方组效果呈优于其余拆方组的趋势。

2.2.3 肝组织Masson染色

如图3所示，各组大鼠肝组织均未出现增多胶原纤维分布，即未形成肝纤维化。

2.2.4 电镜观察

肠细胞紧密连接情况如图4所示，模型组较正常组肠细胞间隙扩大，给药组肠细胞间隙见不同程度减小。每组随机取15处肠间隙，测量该间隙最大值。见表3。可见模型组与其余各组比较，腸细胞间隙明显增大，差异有统计学意义（P<0.05）;大柴胡汤组与除疏肝利胆组外各组比较，肠细胞间隙减小显著，差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

3.1 造模情况分析

NAFLD动物模型大致可分为3类：营养型脂肪肝模型、药物中毒型脂肪肝模型和特殊种系动物的先天性遗传性脂肪肝模型[15]。本实验模拟临床NAFLD常见病因，采用东方人群尤其是中国人多见的高脂高糖饮食喂养SD雄性大鼠建立营养型NAFLD大鼠模型。根据NAFLD活动度积分（NAS）评分，本实验模型组病理评分NAS=4分，说明本实验通过高脂高糖饲料喂养建立的大鼠模型已明确达到非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic Fatty Liver，NAFL）阶段，为向非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic Steatohepatitis，NASH）进展阶段，证明NAFLD模型建立成功。

3.2 大柴胡汤及其拆方对NAFLD疗效分析

肠黏膜屏障主要由机械屏障、化学屏障、免疫屏障、生物屏障等组成[16-17]。其中，机械屏障由肠道黏膜上皮细胞、上皮细胞间紧密连接和黏液凝胶层等构成[18]。最直接、最准确评价肠黏膜屏障功能的量化指标是肠黏膜通透性，肠黏膜通透性取决于肠黏膜上皮细胞是否受到损伤以及细胞间紧密连接是否完整。研究表明，肌球蛋白轻链激酶（MLCK）是细胞收缩的关键酶，可使肌球蛋白轻链磷酸化（MLC），促使肌动蛋白收缩，破坏细胞间的紧密连接蛋白，使细胞骨架收缩，进而使肠上皮通透性增加，肠黏膜机械屏障遭到破坏，致使NAFLD的病情进一步发展[19]。多项研究发现，药物及其有效成分可提高紧密连接蛋白的表达[20-24]，从而减小肠细胞间隙，降低肠黏膜通透性，保护肠黏膜屏障。

中医学依据NAFLD患者临床所见乏力、消化不良、肝区隐痛、肝脾大以及肥胖、空腹血糖增高、血脂代谢紊乱、高血压等代谢综合征相关表现，认为其病机主要为肝脾不和、痰瘀互阻、湿热内蕴。大柴胡汤为《伤寒杂病论》经典名方，全方由“柴胡半斤，黄芩三两，半夏半升，枳实四枚，芍药三两，大黄二两，生姜五两，大枣十二枚”组成，见于《伤寒论》103条：“呕不止，心下急，郁郁微烦者，为未解也，与大柴胡汤下之则愈”;136条：“伤寒十余日，热结在里，复往来寒热者，与大柴胡汤”;165条：“伤寒发热，汗出不解，心中痞硬，呕吐而下利者，大柴胡汤主之”及《金匮要略·腹满寒疝宿食病脉证并治》第12条：“按之心下满痛者，此为实也，当下之，宜大柴胡汤”。其主治症状与NAFLD的临床表现颇为相似。对其组方进行分析：“柴胡配黄芩除少阳之邪;大黄配枳实以泄阳明热结;芍药清胆，缓急止痛，与大黄相配，可治腹中实痛，与枳实相伍，可以理气和血;半夏与生姜配，治呕逆不止。大枣与生姜配，能和营卫而行津液，并调和诸药”[25]，可见全方以柴胡、黄芩、白芍调肝，半夏、生姜、大枣理脾，大黄、枳实通腑泄浊、行气活血、清热化湿，故可针对NAFLD核心病机起到良好的治疗作用。

本实验中，正常组大鼠肠细胞间可见细胞连接复合体，且紧密连接结构较长;造模后细胞连接结构局部出现异常，有些桥粒张力微丝稀疏，某些连接处出现空泡，可见造模导致肠黏膜屏障受损;各给药组大鼠肠细胞间隙减小，说明各药物均能在一定程度上减小肠黏膜间隙，且以大柴胡汤全方明显优于其拆方;肝细胞染色及相关数据亦清晰表明，用药后肝内脂滴数量有所减少，且全方组优于各拆方组。分析其原因如下：NAFLD一病，以患者平素饮食无度为主要病因，肥甘厚腻之品助湿生痰，困阻脾胃，土壅木郁，则肝胆疏泄不利，气机郁滞，血行不畅，久郁化热，形成湿热内蕴、痰瘀互结之证。大柴胡汤一方，以柴胡、黄芩为君药，疏利肝胆，清少阳之邪，以大黄、枳实为臣药，通腑泄浊，泄阳明热结;芍药柔肝缓急止痛，理气和血;半夏、生姜相配，消痞散结，和胃止呕;大枣、生姜相伍，健脾和胃，调和诸药。全方以疏肝利胆为核心，故单用健脾化痰之半夏、生姜、大枣或通腑泄浊之大黄、枳实，效果不如疏肝利胆之柴胡、黄芩、白芍;同时，全方合用，君药之疏肝利胆配以臣药之通腑泄浊及佐使之健脾化痰，效果更佳。可见，针对NAFLD一病，大柴胡汤方药的君臣佐使之配伍亦不可忽视。

综上所述，大柴胡汤及其拆方能减轻NAFLD模型大鼠肠黏膜屏障损伤，降低肠黏膜通透性，保护小肠黏膜及其屏障功能，同时亦能减轻NAFLD模型大鼠肝细胞脂肪变程度。大柴胡汤全方在调节肝脏脂质代谢、保护肠道黏膜屏障方面作用优于单纯“疏肝利胆”“健脾化痰”“通腑泄浊”等要素，说明3个方剂要素配伍具有协同作用，全方总效应大于各要素单独之效应。大柴胡汤对NAFLD模型大鼠“肝-肠轴”形态学的影响，体现出其“肝肠同治”配伍组方的合理性和有效性。

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（2019-07-03收稿 责任编辑：杨觉雄）