延安市结核分枝杆菌耐药性与耐药基因检测结果分析 *

阳 央，侯 欢，王 东，李 慧，冯 智，李芳芹△

1.延安大学医学院，陕西延安 716000；2.陕西省延安市第二人民医院检验科，陕西延安 716000；3.延安大学附属医院检验科,陕西延安 716000

世界卫生组织2019年结核防控报告中提到，2018年中国新发结核病患者约86.6万例，平均发病率为61/100 000，是结核病高负担国，也是耐多药结核(MDR-TB)第二大国家[1]。结核的流行和MDR-TB的出现及持续蔓延，已经成为有效控制结核病的严重威胁；世界卫生组织建议对所有疑似结核病患者进行标准治疗前都应进行结核药敏试验，以避免获得性耐药的进一步产生[2]。延安地处中国西北黄土高原，是结核病较为严重的地区，但本地区结核耐药的流行情况、模式及分子基础仍不清楚，本研究旨在调查延安地区结核耐药流行情况、模式及重要抗结核药物利福平(RIF)、异烟肼(INH)的耐药基因突变特点。

1 资料与方法

1.1一般资料 将延安市第二人民医院2018年1月至2019年8月住院的肺结核患者共302例纳入研究，男181例，女121例(男女比例为 1.49∶1)，其痰液标本按照《结核病实验室检验规程》[3]进行处理。

1.2仪器与试剂 MGIT 320结核分枝杆菌快速培养仪器购自BD公司，培养试剂购自希格生物公司；最低抑菌浓度(MIC)检测的微孔板及试剂购自珠海银科医学公司；Lab-Aid 824全自动磁珠法核酸提取仪购自厦门致善生物科技公司；SLSN-96实时荧光PCR仪购自上海宏石医疗科技公司。

1.3方法

1.3.1药敏表型的检测 将痰液标本用MGIT 320培养仪进行快速液体培养，培养呈阳性并鉴定为结核分枝杆菌的菌株进行结核微孔板MIC法药敏试验，剔除同一患者重复分离菌株的药敏试验结果。

1.3.2耐药基因突变的检测 对RIF、INH有耐药表型的液体培养标本采用磁珠法进行结核分枝杆菌DNA的提取，采用荧光PCR熔解曲线法进行耐药基因突变检测。检测RIF耐药性决定区域 (RRDR)rpoB基因和INH耐药相关基因KatG 315密码子、inhA启动子区(-17至-8位点)、inhA94密码子及ahpC启动子区(-44至-30位点及-15至3位点)是否存在突变来确定耐药性。

1.3.3结核耐药模式 单耐药：仅对一种抗结核药物耐药；多耐药：对一种以上抗结核药物耐药(同时耐RIF、INH的除外)；耐多药：至少同时耐RIF和INH；简单耐多药：只同时耐RIF和INH，而对其他药物无耐药性；复杂耐多药结核：同时耐RIF和INH，外加对其他一种或一种以上的药物耐药；广泛耐药结核(XDR-TB)：耐INH和RIF，同时对任意一种喹诺酮类药物及二线注射类药物(阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素)中的一种耐药；INH耐药但RIF敏感结核(INHR-TB)：对INH耐药，RIF敏感，对其他一线药物有或无耐药性[4]。

1.4统计学处理 采用SPSS22.0软件进行统计分析，计数资料采用百分数表示，组间比较采用χ2或Fisher精确检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1耐药结核病患者的检出情况 共检出耐药结核病患者74例，男性患者的检出率高于女性(P<0.05)；不同年龄段患者间结核耐药率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；合并糖尿病与未合并糖尿病的患者比较，结核耐药率差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。对不同抗结核药物的耐药率如下：链霉素(SM)11.3%(34/302)，INH 17.2%(52/302)，RIF 7.6%(23/302)，对氨基水杨酸(PAS)3.0%(9/302)，乙胺丁醇(EMB)1.3%(4/11)，左氧氟沙星(LVFX)1.3%(4/11)，其余药物的耐药率均较低。

表1 不同性别、年龄段及合并糖尿病情况的肺结核患者发生耐药的情况

2.2RIF与INH耐药基因突变分布 有RIF耐药表型的菌株中，存在rpoB基因突变的占87.0%(20/23)。有INH耐药表型的菌株：存在INH耐药相关基因突变的占96.2%(50/52)；具有KatG 315密码子突变的占76.9%(40/52)，其中3株合并inhA突变，1株合并ahpC突变；具有inhA突变的菌株占17.3%(9/52)；具有ahpC突变的菌株占3.8%(2/52)；3株INH耐药由KatG基因缺失导致；KatG 315密码子和inhA启动子区突变介导了88.5%(46/52)的INH耐药，未发现inhA94密码子的突变菌株。

2.3结核耐药模式的分布 单耐药率为13.6%(41/302)；多耐药率为5.0%(15/302)；耐多药率为6.0%(18/302)，见表2。耐药模式以INHR-TB为主,占46.0%(34/74)。MDR-TB患者平均年龄41岁，男12例，女6例，男女比例为2∶1，其中5例合并糖尿病(男4例，女1例)。耐多药以耐SM+RIF+INH模式常见，占66.7%(12/18)。

表2 结核耐药模式分布(n)

3 讨 论

药物敏感结核患者经过4～6个月的有效抗结核治疗，绝大多数(90%以上)能获得痊愈；而对于MDR-TB及XDR-TB患者，治疗时间最长达24个月。最新的MDR-TB治疗转归数据显示，全球治疗成功率仅有56%[1]。随着新药及快速诊断方法的应用[5-6]，结核病发病率及病死率有所下降。

本研究中，结核的耐药率为24.5%(74/302)，低于全国结核病耐药性基线调查报告(2007-2008年)中的数值(37.8%)[7]；分离的结核分枝杆菌对主要一线药物的耐药情况：除对SM(11.3%)和EMB(1.3%)的耐药率低于全国普查水平(SM：28.93%，EMB：6.52%)外，INH(17.2%)和RIF(7.6%)与全国水平(INH：18.96%，RFP：9.63%)差异不明显；SM耐药率低于全国水平，可能与近20年未将其纳入抗结核治疗药物有关。本研究得出的总体耐药率、单耐药率、多耐药率、耐多药率均高于青岛(19.8%、11.8%、2.9%、5.4%)[8]；单耐药和多耐药率均高于绍兴(5.3%、2.1%)，而耐多药率低于绍兴(12.8%)[9]；总耐药率低于新疆、甘肃、西藏(总耐药率分别为42.9%、40.8%、64.2%)，与内蒙古地区(23.81%)相差较小，RIF耐药率明显低于上述地区，INH耐药率高于甘肃，低于西藏、新疆，与内蒙古相差较小，SM及EMB的耐药率均显著低于上述4个地区[10]。本研究的肺结核患者中，男性多于女性，而且男性相对于女性更易发生耐药，这可能与男性比女性有更多的社会活动，接触肺结核患者的机会更多，治疗的依从性差有关。

在耐药基因突变分析中，87.0%的RIF耐药与rpoB基因突变有关，90.0%以上的INH耐药与KatG 基因、inhA、ahpC基因突变有关，可见熔解曲线法快速检测相关耐药基因突变对于早期识别耐药结核十分重要。本研究中3株耐RIF表型菌株和2株耐INH表型菌株未发现相关耐药基因的突变，可能由其他耐药机制引起或与耐药菌所占比例低有关(熔解曲线法耐药突变检测下限为40%)。rpoB基因突变影响药物的结合是RIF耐药性产生的主要原因，利用分子生物学方法快速发现RIF耐药突变菌株，对治疗的选择和结核的防治至关重要。本研究发现，INH耐药主要由KatG 315密码子引起，KatG 315密码子突变一般认为与较高浓度的INH耐药相关(MIC>6.4 mg/L)[11]，同时，有研究表明KatG 315密码子突变与临床治疗失败、死亡和复发的风险增加有关[12]。本研究还发现了3株菌株存在KatG基因的缺失，KatG基因的缺失会导致极高的MIC(>25.6 mg/L)[13]。由于本地区INH耐药性主要由KatG基因突变介导，不建议对存在INH耐药的患者采取高剂量INH治疗方案。

耐药模式主要以INHR-TB为主，耐多药模式以耐SM+RIF+INH常见，这可能与本地区20世纪广泛使用SM，SM使用历史长，原始耐药率高有关。RIF是一种主要的一线抗结核药物，因其对生长缓慢、甚至休眠的结核杆菌保持活性[13]，因此，在治疗INHR-TB患者时使用RIF可以获得良好的效果。对于特殊人群(老年人、糖尿病患者等)的肺结核治疗，因药物的相互影响，对RIF的毒性及不良反应的不耐受，临床可以选用利福喷丁替代[14-15]。INHR-TB是全球最常见的结核耐药模式，如果采用标准一线治疗可能导致治疗失败和MDR-TB的进一步增多[16-17]，因此，快速、准确地发现这类患者并及时给予针对性的治疗能减少MDR-TB的产生。有研究表明，延长吡嗪酰胺和RIF的持续时间，治疗INHR-TB时使用6～9个月的RIF、吡嗪酰胺和乙胺丁醇(6-9REZ)方案，其不良结果和获得RIF耐药比例明显降低[4]，根据患者病情如果6-9REZ方案中添加氟喹诺酮类药物时，可能会有更好的治疗效果[2]。

MDR-TB的不适当治疗和管理不善，会导致治疗的失败，还可能转变为XDR-TB。因此，对于MDR-TB患者的治疗，最好在获得喹诺酮类及二线注射类药物的药敏试验或分子药敏试验结果后再确定方案。对药物敏感结核应严格按标准方案治疗，不要随意添加药物(特别是喹诺酮类及氨基糖苷类)或减掉某一药物，以避免耐药性的产生，同时管理好药物敏感结核和INHR-TB是抗击MDR-TB产生的关键[2]。基层医院更应该加强宣教和随访，提高治疗依从性。本研究未区分初治和复治患者，但影响不大；95%以上患者都是初治患者，可见本地区结核耐药情况较为严重，特别是INH耐药不容忽视。

综上所述，延安市肺结核主要以药物敏感结核和INHR-TB患者为主，rpoB、KatG 315、inhA基因是本地区RIF、INH耐药的主要基因突变位点。耐药形势依然严峻，INH耐药不容忽视，及早发现INH耐药、MDR-TB，规范地实施个体化治疗，对结核病患者进行有效管理和护理，是控制结核流行的关键。