化学衍生化技术在农药分析中的应用研究

张 婧，王 玥，李红霞，林吉柏

(北京颖泰嘉和分析技术有限公司，北京 102206)

1 概述

农药产品中的活性成分及杂质含量是农药登记注册要求提供的信息。气相/液相色谱是分析检测中最常用的分析方法，已广泛用于农药主成分及其杂质的检验。气相色谱具有分离能力强、灵敏度高、分析快速等优点，但是会受使用条件的限制，不能直接检测一些热稳定性较差或高沸点的物质，通常需要先把这些物质转化为稳定性好或沸点低的衍生物再进行检测。液相色谱检测常使用反相色谱模式，而一些极性强的化合物如草铵膦、草甘膦等却无法在反相柱上保留。用亲水色谱柱可以分析这些强极性待测物，但亲水色谱柱价格昂贵，因此通常先对化合物进行衍生化，再进行检测。此外，农药产品中杂质含量一般较低，有的杂质分子量较小，也不适合用常规的色谱分析方法直接测定其含量。也可以通过适当的衍生化，提高杂质的色谱适用性和灵敏度，从而达到检测要求。因此，在农药分析领域中发展衍生化技术具有重要的意义。

衍生化方式有柱前衍生、柱上衍生和柱后衍生3种。间接分析法中衍生化试剂的选择尤为重要，在选择时需要综合考虑以下几方面的因素：⑴ 衍生试剂必须稳定，不与本底发生反应；⑵ 衍生试剂本身和生成的副产物干扰应尽可能小，衍生化反应的转化率尽可能完全；⑶ 衍生化反应条件不能太苛刻，避免高温高压等条件；⑷ 试剂安全易获得，毒性较小。

本文结合实例，介绍基于衍生化技术定量分析吡蚜酮、乙烯利和咪唑乙烟酸3种农药活性成分或其杂质的方法。

2 吡蚜酮中杂质——水合肼的测定

对于吡蚜酮中杂质——水合肼的测定，常采用ZB G14001-90中规定的方法，即利用水合肼与硫酸生成硫酸肼，在碳酸氢钠存在下，用碘溶液滴定的方法。此方法工作量大，重现性差，准确度不高。本文介绍了测定样品中微量的水合肼的基于衍生化技术的液相色谱法[1]。

2.1 衍生化方法

本实验室用过量的五氟苯甲醛(PFB)衍生水合肼，形成吖嗪化合物(PFBA，图1)。具体为将吡蚜酮样品溶解于乙腈∶超纯水=5∶1(体积比)的混合溶剂中，加入过量的衍生化试剂PFB，充分混合10 min后，用正己烷萃取收集衍生化产物，用GC-ECD检测分析。

图1 水合肼衍生化反应过程

2.2 仪器条件

安捷伦DB-5色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 µm)：起始温度60 ℃，以40 ℃/min升至100 ℃，再以20 ℃/min升至250 ℃，持续5 min。流速：1.0 mL/min(恒流)，不分流。进样量：1 μL，进样口温度：250 ℃，检测器温度：300 ℃。

2.3 结果

衍生化试剂PFB不与主成分吡蚜酮反应，过量的PFB与衍生化产物PFBA能够很好地分离。由于衍生化产物分子中含有10个氟原子，利用ECD检测器进行分析，可以获得较好的响应。研究获得的LOD为0.32 ng/mL，定量的下限是36.5 ng/mL(图2)。此方法适合大多数农药体系中水合肼的定量。

图2 36.5 ng/mL衍生化产物PFBA的气相色谱图

3 乙烯利主成分及相关杂质MEPHA的定量

乙烯利是一种常用的植物生长调节剂，其不仅自身能释放出乙烯，而且还能诱导植株产生乙烯。乙烯利在pH＜3.5水溶液中稳定，随pH升高而水解释放出乙烯；对紫外光敏感，75 ℃以下稳定；沸点约265 ℃(分解)，溶于乙醇、甲醇等极性有机溶剂。MEPHA是植物生长调节剂乙烯利的中间体，也是乙烯利产品中的相关杂质。其沸点124～125 ℃，可在中性至碱性溶液中分解而放出乙烯。MEPHA与乙烯利具有类似的化学结构，对紫外光及热不稳定。FAO明确要求乙烯利中MEPHA的限值为20 g/kg。

图3 乙烯利和MEPHA的结构式

关于乙烯利的分析方法，国际上FAO采用CIPAC方法，即化学法的酸碱滴定法[2]；我国化工行业标准方法是将其经重氮甲烷酯化，以对硝基苯作内标，对乙烯利甲酯进行气相色谱法定量分析[3]。重氮甲烷不稳定且易爆，实验室制备及储存不方便也不安全。《农药分析》[4]一书介绍了一种简单的测定方法即测定乙烯的重量法，但是以上方法的步骤较繁琐，重现性差、误差大。本文介绍一种新的衍生化方法，用N,O-双(三甲基硅基)乙酰胺(BSA)对被试物进行甲基化衍生化后，对衍生化产物进行气相色谱法分析。该方法重现性好，灵敏度高，衍生试剂安全易获得。

3.1 衍生化方法

过量的BSA衍生乙烯利和乙烯利杂质MEPHA中的羟基，形成硅甲烷化衍生产物(图4、图5)。本实验室的具体操作为将含乙烯利或MEPHA的样品溶解于二氯甲烷中，加入过量的衍生化试剂BSA，在(54±2) ℃放置0.5 h，用二氯甲烷定容后用GC-FID检测分析。

图4 乙烯利衍生化反应过程

图5 MEPHA衍生化反应过程

3.2 仪器条件

3.2.1 测定乙烯利的色谱条件

安捷伦DB-5色谱柱(30 m×0.32 mm，0.25 µm)：起始温度：100 ℃，持续1 min，然后以20 ℃/min升温至250 ℃，持续1 min。流速：2.0 mL/min(恒流)，进样口温度：200 ℃，分流比：15∶1，进样量：1 μL，检测器温度：280 ℃。乙烯利的衍生化产物的保留时间为5.0 min。

3.2.2 检测MEPHA的色谱条件

安捷伦DB-5色谱柱(30 m×0.32 mm，0.25 µm)：起始温度：80 ℃，持续1 min，然后以20 ℃/min升温至280 ℃，持续1 min。流速：2.0 mL/min(恒流)，进样口温度：200 ℃，分流比：20∶1，进样量：1 μL，检测器温度：280 ℃。MEPHA的衍生化产物的保留时间为7.0 min。

3.3 结果

3.3.1 乙烯利的测试结果

衍生化试剂BSA能够与乙烯利充分反应，用常规的FID检测器分析衍生化产物，可以获得较好的响应。线性范围为767.14～1 203.72 μg/mL(图6)，线性相关系数为：0.999 7，精密度：1.36%，回收率为：(99.94±0.60)%，无基质效应。衍生化的转化率为：(101.1± 0.75)%。

图6 767.14 μg/mL乙烯利标准品的气相色谱图

3.3.2 MEPHA的测试结果

衍生化试剂BSA能够与MEPHA充分反应，用常规的FID检测器分析衍生化产物，可以获得较好的响应，线性范围为4.87～79.66 μg/mL(图7)，线性相关系数为：0.999 7，精密度：1.76%，在8.0、50.0、78.5 μg/mL 3个浓度下的回收率分别为：(120.46±3.69)%、(103.72±1.25)%、(99.68±0.39)%，研究获得的LOD为2.0 ng/mL，无基质效应。衍生化的转化率为：(100.4±1.91)%。

图7 17.70 μg/mL MEPHA标准品的气相色谱图

4 咪唑乙烟酸中甲醛的定量

常用的甲醛定量方法是通过对甲醛衍生化后进行分光光度法分析[5]，工作量大，不能实现大批量的智能操作。本文采用甲醛衍生化后液相色谱法，分析周期短，衍生化过程简单，没有繁琐的前处理操作。

4.1 衍生化过程

甲醛在过量铵盐存在下，与乙酰丙酮反应，生成二甲基二乙酰基二氢吡啶(DDL)。该化合物在414 nm处有最大吸收，3 h内吸光度基本不变。根据此原理，本实验室的具体操作为将含醋酸铵的乙酰丙酮溶液置于含甲醛的溶液(乙腈∶超纯水=1∶1)中，在(40±2) ℃水浴锅中加热15 min，发生衍生化反应(图6)。衍生化产物DDL经由HPLC-DAD分析。

图8 甲醛衍生化反应过程

4.2 仪器条件

安捷伦XDB-C8色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 µm)；流动相：乙腈∶0.5%HAc=30∶70(体积比)；波长：412 nm。流速：1.0 mL/min，进样量：20 μL，检测器温度：30 ℃。运行时间：7 min。

4.3 结果

衍生化试剂能够与甲醛充分反应，用常规的DAD检测器分析衍生化产物，可以获得较好的响应。线性范围为0.425～3.401 μg/mL (图9)，线性相关系数为：0.999 2，在0.456、0.890、1.707 μg/mL 3个浓度下的回收率分别为：(109.29±1.23)%、(100.62±0.65)%、(99.61±0.56)%，无基质效应。衍生化的产率为：(104.66±0.46)%。

图9 0.850μg/mL甲醛标准品衍生化后的液相色谱图

5 结语

衍生化技术在农药分析中有着不可或缺的重要作用，通过各种衍生化手段，结合HPLC和GC等现代分析仪器与各种检测器(DAD、FID、ECD、MS等)的联用，实现了农药分析检测的高效、快速、高灵敏度、良好的重现性。如何选择合适的衍生化试剂、优化衍生化反应条件、简化衍生化步骤和程序、提高衍生化效率、使衍生产物稳定并便于检测，将是衍生化技术今后需要进一步努力的方向。随着衍生化试剂的丰富多样以及衍生化技术的发展、分析仪器的进步，农药的衍生化分析方法亦将更加灵敏、准确和可靠，在农药分析检测领域亦将发挥更大的作用。