气相色谱法测定饲料中丙酸和丙酸盐含量前处理方法的优化

王 佳 王 珊 雷 浩 马 幸 高勤叶 李 宏 王晓琳 赵彩会

（1.陕西秦云农产品检验检测有限公司，陕西渭南714000；2.陕西省畜牧技术推广总站，陕西西安710016）

丙酸为无色液体，具有挥发性，能与水混溶。丙酸盐主要是指丙酸钙、丙酸钠、丙酸锌等多为白色颗粒或粉末，无臭或稍微有异臭味、溶于水，在酸性条件下，产生游离丙酸[1]。动物饲料中含有丰富的蛋白质、淀粉、维生素等营养物质，是霉菌和细菌生长繁殖的良好培养基。饲料原料或者成品如果发生霉变，会降低饲料的营养价值，严重的会造成畜禽霉菌中毒，甚至死亡。刘莹等[2]和苏基双[3]都报道过丙酸和丙酸盐不仅可以防止食物变质，对各类霉菌、革兰氏阴性杆菌或好氧芽孢杆菌有较强的抑制作用，也还能调节畜禽消化系统的菌群和改善饲料原料的消化率，同时对酵母菌无害，是公认的最经济实惠、安全有效的防霉剂。

目前世界上使用的防霉剂已超50 几种，饲料防霉剂一般可分为有机酸类防霉剂、有机酸盐或酮类防霉剂和复合防霉剂，现行国标GB/T 17815—2018《饲料中丙酸、丙酸盐的测定》中规定检测样品前处理称取试样量为50 g，加入10 ml磷酸溶液、80 g氯化钠和10 g 石英砂，采用水蒸气蒸馏法萃取，甲酸溶液和水溶液定容[4]。国标中整个实验称样量过大，前处理较复杂、试剂消耗量大、步骤繁琐，进行一次完整前处理实验需要近6～8 h，甲酸具有较强的腐蚀性，受公安部门管制，试剂危害大且采购过程繁琐，不是很适合政府监督抽查或第三方检测等实验室快速大量检测工作。同时气相色谱应尽量避免用水作溶剂，因为水的蒸汽膨胀因子大，而且水容易使FID 熄火，降低了气相色谱仪的精密度及缩短使用年限。张凤枰等[5]报道了毛细管气相色谱内标法测定防霉剂中丙酸的方法，内标成本高及前处理操作略显复杂。陈丽珊等[6]在饲料中防霉剂丙酸含量的气相色谱法测定也是采用水蒸气蒸馏方法前处理。张小华等[7]采用的是离子交换法测定，其H型阳离子交换树脂处理和交换柱的填充等操作步骤较多，不适用与快速大量检测试验需求。

本实验通过摸索改进，进行前处理过程简化和优化，将称样量从国标的50 g降低至1.0 g，实验过程加入1 ml硫酸溶液和1 g氯化钠，25 ml乙酸乙酯，涡旋振荡2 min，8 000 r/min离心5 min，取上清液过0.45 μm有机滤膜后上机测定，整个实验前处理过程仅需要1～2 h，可大大节省前处理时间，且实验过程所需试剂量少、易获取、成本低，适合大量快速检测工作。通过实验和方法学论证，优化后的前处理方法，检测准确性好、灵敏度高、重现性好，可替代GB/T 17815—2018气相色谱法蒸馏方法前处理实验步骤。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

气相色谱仪（美国赛默飞TRACE1300），具有FID检测器和自动进样器（美国赛默飞AI1310）；色谱柱TG-WAXMS 0.25 mm×30 m，0.25 μm石英毛细管柱；十万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司MS205DU），2、10 ml 棕色容量瓶（天津市天科玻璃仪器制造有限公司）；2 ml自动进样小瓶。

1.2 主要试剂

乙酸乙酯（色谱纯）、磷酸（优级纯）、硫酸（优级纯）均购自天津市科密欧化学试剂有限公司，氯化钠（优级纯）购自天津市光复精细化工研究所，丙酸对照品（批号P1161219-25）含量≥99.86%，氮气纯度99.999%，试验用水为二级水，其他常用试剂为AR级。硫酸溶液：准确吸取1 ml硫酸加入到9 ml水中。

1.3 色谱条件

进样口温度250 ℃、检测器温度250 ℃、分流进样、分流比50:1、载气流速1.0 ml/min、柱压100.0 kPa、进样量1 μl、升温程序：110 ℃保持5 min，以10 ℃/min升至180 ℃，保持5 min。

2 结果与分析

2.1 酸化过程酸液选择（见表1）

本实验从常用的盐酸、硫酸、磷酸中进行择优选用，实验分别取2 ml 盐酸溶液（1+9），2 ml 硫酸溶液（1+9），2 ml 磷酸溶液（1+9）酸化，使丙酸盐转化为丙酸，在此过程中，固定称样量为1.0 g（精确至0.000 1 g），固定提取液为25 ml 乙酸乙酯，试样为空白样品加标4 553.616 mg/kg，检测结果见表1。结果表明：选用2 ml 硫酸溶液回收率明显高于选用盐酸溶液和磷酸溶液，所以确定2 ml硫酸溶液为本实验前处理的酸化试剂。

表1 酸化过程酸液选择结果

2.2 加酸量选择（见图1）

图1 不同加酸量的GC-FID色谱

在2.1实验中，确定了酸化试剂为硫酸溶液，然后进行酸化试剂使用量确定实验，实验分别加0.5、1、2、3、5 ml硫酸溶液进行酸化，超声提取10 min。其余步骤固定，即称样量为1.0 g（精确至0.000 1 g），提取液为25 ml乙酸乙酯，试样为空白样品加标7 968.828 mg/kg，进行实验，结果为加硫酸溶液为0.5、1、2、3、5 ml 时，回收率为66.21%、102.04%、96.94%、66.50%、68.55%（见图1）。结果表明：当试样质量为1 g左右时，加1 ml硫酸溶液能将试样中丙酸和丙酸盐充分转化，测得结果效果最好。

2.3 提取液选择（见图2）

本实验在选择提取液方面，把实验室常用提取液乙酸乙酯、乙醚、乙醇、丙酮进行了对比实验，其余步骤固定，即称样量为1.0 g（精确至0.000 1 g），加入1 ml硫酸溶液，试样为空白样品加标7 968.828 mg/kg，进行试验。结果回收率分别为：99.18%、47.61%、24.27%、51.06%（见图2）。结果表明：选用乙酸乙酯为萃取液进行实验，能达到最佳萃取效果，所以选择乙酸乙酯为本实验前处理提取液。

图2 不同提取液的GC-FID色谱

2.4 称样量选择（见图3）

在确定1 ml 硫酸溶液为酸化试剂，25 ml 乙酸乙酯为提取液后，对称样量进行精细划分，实验分别称取0.1、1、3、5 g 试样进行实验测定，试样为空白样品加标4 553.616 mg/kg。回收结果分别为:92.15%、93.44%、75.37%、49.51%（见图3），结果表明：在称样量为1.0 g时，样品能达到最大溶解，丙酸和丙酸盐能达到最大化提取，所以 确定称样量为1.0 g。

图3 不同称样量的GC-FID色谱

2.5 方法的线性关系

贮备液的配制：在十万分之一天平，准确称取0.011 40 g丙酸标准品于10 ml棕色容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容至刻度，配置成浓度为1 138.404 μg/ml的丙酸标准贮备液。

标准曲线的配制:分别吸取上述贮备液0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 ml于10 ml棕色容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀，配制成浓度依次为11.384 04、22.768 08、45.536 16、113.840 4、227.680 6、455.361 6 μg/ml的系列标准溶液，测定其丙酸的峰面积，以丙酸峰面积Y对丙酸浓度X作图，求得回归方程Y=0.002 2X+0.024 8，r2=0.999 9，说明在11～450 μg/ml 范围内，FID 的响应与丙酸的浓度呈线性关系。同时，以S/N=3计算检出限，本实验丙酸检出限为0.68 mg/kg（色谱图见图4）。

图4 标准曲线图、定量限GC-FID色谱

2.6 精密度试验（见表2）

表2 精密度试验结果

称取平行试样6 份，按上述确定参数进行前处理，测定结果、平均值、相对标准偏差，具体结果见表2。结果表明：按照优化后的前处理方法测定试样中丙酸的相对标准偏差为0.99%，方法重现性极好。

2.8 回收率试验（见表3）

分别向1.0 g左右的样品中加入2 846.01、5 692.02、11 384.04 mg/kg丙酸标品制成试样，分别进样，记录峰面积并计算回收率，结果见表3。结果表明，按照优化后的前处理方法处理后，进行上机测定结果，平均回收率达到90.8%～104.1%，符合试验要求，样品测定结果准确。

表3 回收率试验结果

3 讨论

随着我国饲料工业的不断发展，国内报道了很多测定饲料中丙酸和丙酸盐含量的方法，但存在要么称样量或试剂用量大，要么前处理方法较复杂，不适用大批量快速检测等问题。本文结合实验室大量快速检测需要，建立了硫酸酸化、乙酸乙酯萃取的FID 检测饲料中丙酸和丙酸盐的测定方法，没有采用水蒸气蒸馏法前处理，避免了使用水进行定容，一定程度保护了色谱柱，延长了色谱柱的使用寿命，该方法操作简单、重现性好、灵敏度高，能够满足饲料中丙酸及丙酸盐的检测要求。该方法简便、快速、准确，对各相关检测机构和生产企业有一定的参考价值。