一株仿刺参源鼠李糖乳杆菌XX-11 生物学特性研究

邹文政 林松泉 李忠琴 乔欣君 林章秀

（1.集美大学水产学院，福建厦门361021；2.厦门惠盈动物科技有限公司，福建厦门361023）

在养殖业中，随着抗生素、化学杀菌剂的普遍使用，已经逐渐地带来一系列的弊端，如病菌耐药性产生、药物残留、肠道正常菌群失调，环境污染等。根据农业农村部第194 号公告通知，2020 年全面禁抗：饲料端“禁抗”，养殖端“减抗、限抗”，最终目的是要解决抗生素在环境污染、健康安全、耐药性超强细菌等负面影响。所以养殖行业必将朝着减抗替抗的趋势发展。在2019 年12 月份正式实施的《水产动物饲用乳酸菌筛选标准》和《水产动物饲用芽孢杆菌筛选标准》，规范了水产养殖益生菌特别是乳酸菌和芽孢杆菌的筛选，其中安全性规定所筛菌株对水产动物和人类都必须是安全的，且无抗生素耐药性及致病性。

益生菌是有利于宿主健康作用的单细胞微生物或组成明确的混合微生物[1]，能调节肠道菌群平衡，增强机体免疫力等[2]，其与抗生素一样具有抗菌活性却无抗生素的种种副作用，是抗生素的重要替代品之一[3]。益生菌主要以乳酸菌类与芽孢杆菌类为主，乳酸菌能够调节养殖水体环境及水产动物肠道微生态平衡，产生抗菌物质，抑制有害细菌的生长，且能定植肠道[4-7]。据报道[8]，为了防止有关疾病的发生，只有摄入含有106cfu/ml或以上的益生菌才能充分发挥其健康促进特性。

益生菌经胃到肠道内的存活能力强弱，是直接关系到产品能否发挥有益作用。因此益生菌耐酸耐胆汁的特性是评价菌株是否能在肠道中生存与定植的一个重要指标[9]。一般对于作用于人体的益生菌的胆盐耐受实验，推荐胆盐浓度为0.15%～0.3%[10]。根据饮食结构不同，人体胃液pH值具有不同程度的波动，通常pH值维持在2.5～3.5之间，空腹pH值最低可达1.5，在进食后pH值可上升至6或更高，通常食物在胃内停留时间为2～4 h，流食通过胃的时间相对较短，一般1～2 h[11-13]。

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，为革兰氏阳性菌，兼性厌氧菌，属于乳杆菌属。目前鼠李糖乳杆菌被认为是第三代微生物益生菌发酵菌种[14]，它不仅能够在肠道中定植，能耐胃酸、胆汁，还能预防或治疗腹泻、预防龋齿、增强机体免疫力及抗癌等作用[15-16]。

课题组从仿刺参肠道内分离得到一株益生菌，通过16S rRNA 测序及生理生化鉴定为鼠李糖乳杆菌XX-11，目前尚未见仿刺参源鼠李糖乳杆菌的相关报道。因此，本文对鼠李糖乳杆菌XX-11的部分生物学特性进行研究，旨在为后续产品开发、生产应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌种

鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）XX-11：由本实验室分离自健康仿刺参肠道，保存于-80 ℃冰箱。

抑菌试验指示菌株：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GDMCC1.372、大肠杆菌(Escherichia coli)CMCC44102、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC26003、乙型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi-B）CMCC50094 购自广东省微生物菌种保藏中心，创伤弧菌（Vibrio vulnificus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、鳗弧菌（V. anguillarum）、副溶血性弧菌（V. Parahemo⁃lyticus）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）由集美大学水产学院提供。

1.1.2 培养基

采用MRS 培养基作为培养鼠李糖乳杆菌培养基，其中抑菌试验所用MRS培养基不加吐温。

1.1.3 药品试剂

10 种药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司；胃蛋白酶购自美国sigma公司；猪胆盐购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.4 设备

SW-CJ-2FD 超净工作台，苏州净化设备有限公司；MJX-250 恒温培养箱，上海申贤恒温设备厂；LDZX-50KBS 压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；DW-86L400超低温冰箱，浙江捷盛低温设备有限公司；TG-16M高速冷冻离心机，山东博科科学仪器有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株活化

将保藏于-80 ℃低温冰箱的鼠李糖乳杆菌XX-11冻存管取出，接种于斜面活化18 h后，转接于MRS液体培养基，装液量90 ml/100 ml，30 ℃静置培养18 h。

1.2.2 菌株盐度耐受性试验

以MRS 液体培养基为基础，其中醋酸钠改为氯化钠来达到调节盐度[17]。设置NaCl 质量浓度分别为10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85 g/l 液体培养基，装液量200 ml/250 ml，按2%接种量接入活化菌液，30 ℃静置培养24 h。观察培养基浊度变化，确定菌株生长情况。

1.2.3 菌株适宜生长温度测定试验

参考陈佩等[18]方法进行，以对数生长期的鼠李糖乳杆菌培养液按2%接种量接入装液量400 ml/500 ml的MRS 液体培养基，分别在温度25、30、35、40 ℃与45 ℃培养箱中静置培养24 h，每隔4 h取样检测菌液OD600nm值。

1.2.4 菌株药物敏感性试验

采用药敏纸片琼脂扩散法[19]，吸取1 ml活菌数约为108cfu/ml 的菌液，加入15 ml MRS 琼脂培养基中（50 ℃），混合均匀后倾注倒入灭菌培养皿中，冷却凝固后贴上药敏纸片，静置15 min后，将平皿置于30 ℃恒温培养箱中厌氧培养24 h，观察并测量抑菌圈直径。

1.2.5 抑菌试验

采用管碟法[20-21]进行菌-菌和菌培养液-菌的抑菌试验。鼠李糖乳杆菌XX-11于MRS液体培养基培养48 h 后，10 000 r/min 离心10 min，取上清液置4 ℃冰箱备用；菌沉淀用无菌生理盐水清洗，离心，重复2 次后，用无菌生理盐水重悬并调节菌浓度约为108cfu/ml，置4 ℃冰箱备用。取1 ml 指示菌菌悬液加入50 ℃100 ml MRS琼脂培养基中摇匀（菌终浓度为105cfu/ml），倒入培养皿中（厚度约为3 mm），待冷却凝固后将牛津杯置于平板中，往牛津杯中加入0.20 ml上清液或菌悬液，置于37 ℃下培养24 h，其中弧菌采用30 ℃培养，观察有无抑菌圈产生，并用游标卡尺测量抑菌圈直径大小。

1.2.6 菌株模拟胃液耐酸性试验

人工胃酸配置方法[22]：0.2 g NaCl与0.35 g胃蛋白酶溶解于适量蒸馏水中，用1 mol/l 盐酸调节pH 值为2.0、2.5、3.0，用100 ml容量瓶定容至刻度。将鼠李糖乳杆菌活化后的培养液离心，取菌沉淀稀释至活菌数约108cfu/ml，分别按1‰接种量加入不同pH 值的人工胃酸液体中，37 ℃水浴恒温处理时间为0.5、1、2、4、6 h后，稀释涂板，37 ℃下培养24 h后，计算菌存活率。

1.2.7 菌株模拟肠液耐胆盐试验

参照徐义刚等[23]、赵瑞香等[24]方法进行，将鼠李糖乳杆菌XX-11活化后的培养液离心，取菌沉淀稀释至活菌数约108cfu/ml，分别按1‰接种量分别加入0.3%、0.5%与0.7%质量浓度的猪胆盐溶液中，37 ℃水浴恒温处理0.5、1、2、4 h 与6 h 后，稀释涂板，37 ℃下培养24 h后，计算菌存活率。

1.2.8 菌株安全性试验

参照冼琼珍等[25]方法进行，以鼠李糖乳杆菌XX-11 采用MRS 液体培养基，厌氧培养24 h 检测活菌数后，放置4 ℃冰箱冷藏备用。15只健康小鼠，5只为正常对照组，饮洁净水；另10 只为试验组，每天饮水添加鼠李糖乳杆菌XX-11 培养液，使菌终浓度为108cfu/ml，连续10 d，每天观察小鼠生长情况及10 d后小鼠内脏器官是否出现病变情况。

2 结果与分析

2.1 菌株盐度耐受性

微生物对溶液渗透压会有一定程度的耐受性，渗透压低则出现细胞吸水而使细胞胀破，即水溶现象；渗透压高则出现细胞失水，造成质壁分离现象。渗透压过低、过高都会导致微生物细胞死亡。不同的微生物具有不同的耐受渗透压程度范围，所以耐受渗透压能力也是评价微生物菌种优劣的一个重要指标。本试验鼠李糖乳杆菌XX-11 在不同的盐度范围内的生长情况如表1所示。

表1 鼠李糖乳杆菌XX-11在不同盐度下生长情况

由表1 可知，鼠李糖乳杆菌XX-11 在NaCl 质量浓度为10～65 g/l 范围内生长情况良好，可耐受NaCl质量浓度为70～80 g/l，但生长缓慢，高于85 g/l的NaCl质量浓度则无法正常生长。该研究结果与辛羚等[17]对乳酸菌耐盐度的研究基本一致，进一步说明鼠李糖乳杆菌能耐受高盐度的环境。

2.2 菌株适宜生长温度

有研究表明[26]鼠李糖乳杆菌的最适生长温度范围在30～40 ℃。本研究结果显示（图1），鼠李糖乳杆菌XX-11 在25～40 ℃温度区间都能良好生长，45 ℃鼠李糖乳杆菌XX-11 生长受抑制。在温度35 ℃、40 ℃培养时，0～4 h为迟缓期，4～16 h为对数生长期，16 h后进入稳定期。这与陈佩等[18]、罗素贤等[27]、刘颖等[28]的研究结果基本相符。而25 ℃与30 ℃培养时，0～8 h为迟缓期，8～24 h处于对数生长期，与35、40 ℃相比，鼠李糖乳杆菌的生长出现滞后现象。结果表明，鼠李糖乳杆菌较适宜生长温度为35～40 ℃。

图1 不同温度下鼠李糖乳杆菌XX-11的生长情况

2.3 菌株药物敏感性

在养殖业中，随着抗生素的广泛使用，从而逐渐导致细菌耐药性增强。细菌耐药性的提高有利有弊，一方面在使用抗生素的同时，益生菌能在肠道存活，能尽快使肠道菌群达到平衡，从而降低胃肠道的不适[29-30]。另一方面，有研究表明[31-33]，细菌耐药性基因能在微生物菌群间相互传递，而使某种病原菌获得耐药性，因此菌株耐药性的安全问题受到极大关注。在2019 年12 月份实施的《水产动物饲用乳酸菌筛选标准》和《水产动物饲用芽孢杆菌筛选标准》中明确规定所筛菌株对水产动物和人类都必须是安全的，无抗生素耐药性及致病性。所以对鼠李糖乳杆菌进行抗生素耐药性的测试显得极其重要。本研究鼠李糖乳杆菌XX-11对10种抗生素药敏纸片敏感性见表2。

由表2 可知，鼠李糖乳杆菌XX-11 对痢特灵、复方新诺明与诺氟沙星有一定程度的耐药性，而对青霉素、氯霉素、庆大霉素、四环素、链霉素与红霉素等7种药物表现敏感。这与单晓峰等[34]研究报道的鲤鱼肠道乳酸菌对庆大霉素耐药，何亚婷等[35]从鲫鱼分离出来的鼠李糖乳杆菌对四环素与红霉素耐药以及团头鲂分离出来的鼠李糖乳杆菌对红霉素耐药等研究结果不同。这表明，不同来源益生菌如鼠李糖乳杆菌对药物的敏感性差异较大。

表2 鼠李糖乳杆菌XX-11对10种药敏纸片的敏感性

2.4 抑菌试验结果

有研究表明[36]鼠李糖乳杆菌能产生对其他革兰氏阴性或阳性的病原菌具有抑制作用的细菌素，它具有蛋白质部分性质，但对热与酸具有良好的稳定性[37]，能较好地保持活性。本研究培养48 h 的鼠李糖乳杆菌XX-11及培养上清液对枯草芽孢杆菌等10株指示菌的抑菌结果如表3所示。

由表3可知，鼠李糖乳杆菌XX-11及其48 h培养上清液对枯草芽孢杆菌等10 株指示菌都有抑制，但前者对10 株指示菌的抑制效果差异不明显，而上清液对弧菌类病原菌表现出极敏感。此外，鼠李糖乳杆菌XX-11 培养上清液的抑菌效果均较菌体抑菌效果好，这可能是起抑菌作用的主要是代谢产物，且最关键抑菌成分可能是代谢产物中的细菌素[39-41]。

表3 鼠李糖乳杆菌XX-11及培养上清液对10株指示菌的抑菌效果

2.5 菌株耐酸性

有报道[42-43]鼠李糖乳杆菌能耐胆酸及有效黏附于肠道中，本研究通过配置人工胃液，鼠李糖乳杆菌XX-11在不同pH值条件下处理其存活率如表4所示。

由表4可知，鼠李糖乳杆菌XX-11在pH值2.0经过1 h 后存活率仅为1.6%，2 h 为0%；而在pH 值2.5、pH 值3.0 的条件下，经过1 h 后存活率超过99%，2 h后仍有很高的存活率，分别为85.8%和99.4%。鼠李糖乳杆菌XX-11 在pH 值3.0 经过4 h 存活率达到86.4%，6 h 后存活率达到68.5%。这与陈佩等[18]的研究在pH 值3.0 处理3 h 存活率大于80%的结果一致。这说明鼠李糖乳杆菌在没有营养的条件下能在胃蛋白酶及酸性pH 值2.5 共同作用情况下还能有良好的存活率，能通过胃消化从而大部分菌体进入肠道。

表4 鼠李糖乳杆菌XX-11对人工胃液耐受性结果

2.6 菌株耐胆盐性

小肠中胆汁盐含量在0.03%～0.3%范围内波动[11]，食物在小肠中停留时间为1～4 h。鼠李糖乳杆菌要定植于小肠，这就要求鼠李糖乳杆菌能耐受一定浓度的胆汁，而对人体益生菌的胆盐耐受试验，推荐胆盐浓度在0.15%～0.3%[44]。因此，本试验采用猪胆盐浓度为0.3%、0.5%、0.7%，在37 ℃条件下保温至6 h，通过检测活菌数来确定其存活率，结果如表5所示。

表5 鼠李糖乳杆菌XX-11对猪胆盐耐受性结果

通过表5试验数据可知，鼠李糖乳杆菌XX-11在猪胆盐浓度在0.3%与0.5%经过37 ℃处理6 h其存活率基本变化不大，存活率皆高于99%以上，这与Haar⁃man 等[45]的研究较为一致。当猪胆盐浓度提高至0.7%时，0.5 h 后鼠李糖乳杆菌XX-11 的存活率下降至89.4%，但延长至6 h 时其存活率变化不大，均在85%以上。这说明本研究中的鼠李糖乳杆菌XX-11能耐受较高的猪胆盐浓度，可在小肠内存活。

2.7 菌株的安全性

鼠李糖乳杆菌XX-11在MRS液体培养基24 h后，将培养物添加到小鼠饮水中（终浓度为108cfu/ml），连续喂养10 d 后，对照组及试验组小鼠均健康活泼、无异常表现。剖检未见任何器官、消化道出现病变。这表明鼠李糖乳杆菌XX-11对小鼠安全无毒副作用。

3 结论

本文通过对仿刺参源鼠李糖乳杆菌XX-11 的部分生物学特性进行研究，结果显示该菌株能耐高盐度、胃酸与高胆盐，且对多种抗生素敏感；通过抑菌试验与小鼠安全性试验表明，该菌株及其培养液能抑制指示菌特别是水产病原菌生长，且对小鼠无毒副作用。以上结果表明，鼠李糖乳杆菌XX-11既符合微生态制剂的要求，又符合《水产动物饲用乳酸菌筛选标准》的要求，使用安全，可作为水产（如海参）、畜禽动物饲料添加的益生菌，甚至在开发乳酸菌产品功能方面与水产、畜禽动物保健方面具有广阔的应用前景。