发酵健鸡散工艺筛选及对白羽肉鸡生长性能的影响

汪 鹏 徐嘉欣 黄 鹏 刘 薇 曾建国*

（1.湖南农业大学 生物科学与技术学院，湖南长沙410128；2.湖南农业大学 湖南省中兽药重点实验室，湖南长沙410128；3.湖南农业大学 动物医学院，湖南长沙410128；4.湖南农业大学 动物科学技术学院，湖南长沙410128）

自20世纪50年代发现亚治疗剂量抗生素有促进畜禽生长的功效以来，饲料中添加抗生素已成为提高养殖效益的有效手段，给畜禽生产带来了巨大的经济效益[1-3]。

近二十年来，人们认识到在养殖业中规模化使用饲用抗生素会引起耐药菌及药物残留、环境污染[4]等问题，严重威胁人类公共健康安全[5-6]。欧盟于2006年6 月开始全面禁止饲用抗生素在食品用动物饲料中添加使用，而中国也在2020 年开始禁止饲用抗生素的添加使用。为响应养殖业绿色发展和兽用抗菌药使用减量化行动，安全、有效、可控的新的抗生素替代产品随着市场和政策应运而生[7-8]。因此，如何解决这个问题成为当下研究焦点。

“健鸡散”作为中华人民共和国兽药典方中的复方中药配方，由党参(20 g)、黄芪(20 g)、茯苓(20 g)、六神曲(10 g)、麦芽(10 g)、山楂(炒)(10 g)、甘草(5 g)、槟榔(炒)(5 g)八味中药组成[9]。已有研究表明其具有增加肉鸡成活率和体重的功效[10-11]。本实验选取了两种益生菌对“健鸡散”进行固态发酵，并通过肉鸡饲喂试验对“健鸡散”发酵前后的生长效果等进行了对比，取得了较好的效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试剂

酵母浸出粉、胰蛋白胨、琼脂、麦芽粉购于赛默飞世尔科技公司；NaCl 购于国药集团化学试剂有限公司；健鸡散购于阜南诺伟康生物科技有限公司；甲醇为色谱纯，购于默克医药生物科技公司。

1.1.2 菌种

鲁氏接合酵母菌（Zygosaccharomyces rouxii CCTCC AY 93099，Zr CCTCC AY 93099）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis CCTCC AB 90008，Bs CCTCC AB 90008）均购于中国典型培养物保藏中心（China Center For Type Culture Collection，CCTCC）。

1.1.3 培养基

LB固体培养基：200 ml超纯水、2 g胰蛋白胨、1 g酵母提取物、2 g NaCl，溶于200 ml蒸馏水中，用1 mol/l NaOH 调至pH 值为5.8，加3 g 琼脂粉，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

LB液体培养基：200 ml超纯水、2 g胰蛋白胨、1 g酵母提取物、2 g NaCl，溶于200 ml蒸馏水中，用1 mol/l NaOH调至pH值为5.8，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

YM固体培养基：1 000 ml超纯水、5 g胰蛋白胨、3 g酵母提取物、3 g麦芽粉，溶于200 ml蒸馏水中，用1 mol/l NaOH 调至pH值为5.8，加20 g琼脂粉，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

YM液体培养基：1 000 ml超纯水、5 g胰蛋白胨、3 g 酵母提取物、3 g 麦芽粉，溶于200 ml 蒸馏水中，用1 mol/l NaOH 调至pH 值为5.8，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

真空干燥箱(上海和晟仪器科技有限公司)，恒温培养箱(上海智城分析仪器制造有限公司)，2 L三角瓶[四川蜀玻(集团)有限责任公司]，超净工作台(CJ-1D，天津市泰斯特仪器有限公司)，摇床(上海智城分析仪器制造有限公司)，冰箱(海尔冰箱有限公司)，千分之一天平(天津市德安特传感技术有限公司)，高温灭菌锅(上海博讯实业有限公司)，超高效液相色谱仪(Agilent 1260 Infinity Series HPLC 色谱系统)，离心机(eppen⁃dorf，Centrifuge 5418；Labogene ApS，DK-3450 Lynge Denmark)，超声仪(昆山市超声仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 梯度条件发酵健鸡散

分别考察发酵温度、发酵时间、菌种接种量、含水量四个因素对酵母菌和枯草芽孢杆菌发酵的影响。含水量（V/W 水体积/底料重量）分别设置为50%、60%、70%、80%、90%，设置发酵温度为30 ℃，发酵时间为3 d，菌种接种量为3%；发酵温度分别设置为24、26、28、30、32 ℃，发酵时间为3 d，菌种接种量为3%，含水量为70%；发酵时间分别设置为1、2、3、4、5 d发酵温度为30 ℃，菌种接种量为3%，含水量为70%；菌种接种量（V/W 菌液体积/底料重量）分别设置为1%、2%、3%、4%、5%发酵温度为30 ℃，发酵时间为3 d，含水量为70%。

1.3.2 供试品前处理

取2 g健鸡散或发酵健鸡散粉末，精密称定，加入25 ml甲醇，超声提取30 min，离心5 000 r/min 10 min，取上清，0.22 μm滤膜过滤备用。

1.3.3 HPLC色谱条件

色谱柱：Unitary C18 5 μm 100A(250 mm×4.6 mm)；检测器：Agilent 1290 Infinity Series HPLC 色谱系统，包括Agilent G1315 DAD 检测器、Agilent G1315 C 梯度四元泵和AgilentOpenLab工作站；流动相：A(甲醇)，B(0.1%甲酸水)，二元梯度洗脱，梯度洗脱条件为：0～2 min，A(%)5～5，B(%)95～95；2～8 min，A(%)5～13，B(%)95～87；8～25 min，A(%)13～30，B(%)87～70；25～28 min，A(%)30～43，B(%)70～57；28～40 min，A(%)43～60，B(%)57～40；40～50 min，A(%)60～90，B(%)40～10；50～55 min，A(%)90～90，B(%)10～10；55～56 min，A(%)90～5，B(%)10～95；56～60 min，A(%)5～5，B(%)95～95，检测波长：270 nm；检测柱温：35 ℃；灵敏度：0.8AUFS；流速：1 ml/min；样品进样量：5 μl。

1.3.4 白羽肉鸡饲喂及管理

选取120只1日龄左右，体重相近的白羽肉鸡，随机均分为4组，分别是空白对照组、健鸡散对照组、Bs CCTCC AB 90008发酵组以及Zr CCTCC AY 93099发酵组，每组3 个重复，每个重复10 只鸡。实验组按照每1 kg 添加20 g 健鸡散或发酵健鸡散配制基础日粮。已有研究表明，使用饲料添加剂的标准是在整个饲养期间，或从1 日龄开始饲喂添加剂，所以试验中白羽肉鸡42 d 生长周期全程进行添加饲喂发酵健鸡散[12]。严格按照肉鸡饲养作业规范进行相关管理，每天记录鸡舍的温度和湿度，并根据鸡的日龄数做相应的调整，观察鸡群精神状态、采食及饮水情况，记录相关发病和死亡情况。在生长前3 d，环境温度为34 ℃，第3 d至第11 d环境温度逐渐降低到25 ℃，期间持续保持良好通风，相对湿度为50%～65%。照明时间为在第一周每天23 h的光和1 h的黑暗，之后18 h的光和6 h的黑暗[13]。

1.3.5 生长数据记录

从1日龄开始记录各组的日粮消耗量、死鸡数量和体重以及第42 d每只鸡的体重。

2 结果与分析

2.1 HPLC检测健鸡散

2.1.1 健鸡散不发酵HPLC峰图

通过高效液相色谱仪对健鸡散成分的分析（见图1），可以发现由八味中药混合制成的健鸡散成分极其复杂，并且不易发现健鸡散的主要成分，无法仅通过对某一种化学成分的含量高低来确定药效，推测其为多种类型物质协同作用而产生功效。主要包括有部分多糖类、黄酮类、皂苷类、以及生物碱等。

图1 健鸡散HPLC

2.1.2 Zr CCTCC AY 93099单因素梯度发酵HPLC检测总峰面积变化

复方健鸡散由八味中药按一定比例混合而成，成分复杂，多以相互协同作用而起到效果。在Zr CCTCC AY 93099 发酵健鸡散的单因素实验中，根据发酵后HPLC 的总峰面积评定发酵效果。根据图2（A）可知，当发酵时间为4 d时，健鸡散的总峰面积最大；图2（B）结果显示菌种接种量为6%时，峰面积达到最大；图2（C）显示60%含水量时，峰面积达到最大；图2（D）显示当温度为30 ℃时，峰面积达到最大。因此，Zr CCTCC AY 93099发酵健鸡散最佳工艺为发酵时间4 d、菌种接种量6%、含水量60%和发酵温度30 ℃。

2.1.3 Bs CCTCC AB 90008单因素梯度发酵HPLC检测总峰面积变化

在Bs CCTCC AB 90008 发酵健鸡散的单因素实验中，根据发酵后HPLC 的总峰面积评定发酵效果。根据图3（A）可知，当发酵时间为4 d 时，健鸡散的总峰面积最大；图3（B）结果显示菌种接种量为4%时，峰面积达到最大，分析可能由于枯草芽孢杆菌属于需氧菌，菌种过多造成发酵环境供氧不足，影响菌体活性；图3（C）显示80%含水量时，峰面积达到最大；图3（D）显示当温度为32 ℃时，峰面积达到最大。因此，Bs CCTCC AB 90008发酵健鸡散工艺为发酵时间4 d、菌种接种量4%、含水量80%和发酵温度32 ℃。

2.2 健鸡散及其发酵产物对白羽鸡生长性能影响

为了检查健鸡散及其发酵产品对白羽肉鸡促生长的效果，对1～42 日龄白羽肉鸡进行健鸡散发酵前后饲喂对比实验，对同一养鸡场饲养的白羽肉鸡出栏（第42 d）期进行了测量（见表1）。

与空白组的体增重相比，健鸡散组平均体增重分别提高4.6%，Bs CCTCC AB 90008 组提高了13.1%，Zr CCTCC AY 93099 组提高了1.33%。因此，Bs CCTCC AB 90008组的体增重效果较佳。

与空白组的FCR 相比，健鸡散组FCR 降低了5.83%，Bs CCTCC AB 90008 组降低了2.43%，Zr CCTCC AY 93099组降低了10.68%。因此，Zr CCTCC AY 93099 组FCR 降低最多，而两个实验组都比空白对照组的FCR低，说明经过微生物发酵后的健鸡散提高了白羽肉鸡的生长性能。

3 讨论

本研究采用HPLC 法以梯度洗脱的方式测定了发酵前后总峰面积的变化。由检测结果可知，健鸡散经过微生物发酵后，有部分吸收峰发生了改变，并且发酵温度、发酵时间、菌种接种量、含水量等因素都影响微生物发酵效率。随着发酵条件的梯度变化，都能够使某一种或多种物质含量增加或减少，表明微生物在发酵过程中可能将其利用、分解成为其他新的物质。但由于健鸡散由八种中药复配而成，不易考察其某一种主要效应物质，推测其是多成分协同作用，所以本实验中暂未开展正交试验，该部分工作将在后续实验中找到复方中药效应物质后进行。在动物实验中，发酵健鸡散对白羽肉鸡的体重有所增加，FCR 有所降低，能够一定程度改善经济效益，推测与其中某些成分含量的增加或者减少有关。但是究竟是产生了何种新的物质或是哪一物质起到关键性作用以及如何对动物发生作用的机理还有待于进一步的深入研究。

图2 Zr CCTCC AY 93099单因素梯度发酵健鸡散的HPLC总峰面积变化

近年来的研究发现，无论是中草药添加剂，还是经过微生物发酵再添加至肉鸡基础日粮使用，均能不同程度地提高肉鸡生长性能，并提高其成活率[14]。张波等[15]研究发现健鸡散具有免疫新城疫的作用但不会产生耐药性等不良影响。因此，发酵中兽药在未来是极具开发潜力的饲用抗生素替代品，健鸡散的发酵研究更为进一步替抗产品开发提供指导性思路。

图3 Bs CCTCC AB 90008单因素梯度发酵健鸡散的HPLC总峰面积变化

表1 健鸡散及其发酵产物对白羽鸡生长性能影响

注：数据表示为“平均值±标准差”；同列数据肩标小写字母不同表示显著差异（P<0.05），字母相同或无字母表示差异不显著（P>0.05）；料肉比：使用单因素方差分析和Duncan's 在SPSS 18.0 版中进行的多重比较分析，分析了生长表现数据。

项目空白健鸡散Bacillus subtilis(CCTCC AB 90008)Zygosaccharomyces rouxii(CCTCC AY 93099)白羽肉鸡(42 d)采食量(g)3 926±164.77abc 3 879.15±151.59ab 4 360±266.86d 3 593.32±362.18a体增重(g)1 919±203.69 2 008±106.07 2 171±186.07 1 945±89.63料肉比(FCR)2.06±0.19ab 1.94±0.17ab 2.01±0.06ab 1.84±0.11a

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