生氰糖苷脱毒菌株筛选及其发酵亚麻籽饼研究

郭宝珠 蔡辉益 王茂森 逯春香 刘国华 常文环 郑爱娟 陈志敏

（1.中国农业科学院饲料研究所 生物饲料开发国家工程研究中心农业农村部生物饲料重点实验室，北京100081；2.张家口市畜牧技术推广站，河北张家口075000）

亚麻（亦称胡麻）是一种在温带地区广泛种植的油料作物[1]。亚麻籽饼粕为亚麻籽榨油后的副产物，其粗蛋白质含量为32.2%～34.8%，可作为蛋白质饲料原料[2]。此外，亚麻籽饼粕富含多种生物功能活性成分，如α-亚麻酸、木酚素等[3]，具有较高的饲用潜能。但是，亚麻籽饼粕存在抗营养物质[4]，如CGs、亚麻籽胶、抗维生素B6因子等,其中CGs 极大地限制了亚麻籽饼粕在动物饲粮中应用[5]。前人对CGs脱毒做了大量研究，脱除亚麻籽饼粕中CGs 的传统方法有水煮法、溶剂法、挤压法、烘烤法等，近年来又出现了微波法和酶法，而这些方法都存在不同程度的缺陷，难以在生产实际中应用[6]。随着微生物发酵饲料的逐渐兴起，人们发现了微生物在脱除饲料原料抗营养因子中的优势，微生物不仅能降解抗营养因子，还能提高饲料原料的营养价值[7]，而且微生物发酵具有成本低、营养物质损失小等优点[8]。微生物发酵在亚麻籽饼粕脱毒研究方面也得到了应用，但是先前对发酵亚麻籽饼粕的研究[6，9-10]还有许多方面需要改进，第一，先前研究中所用天然菌株类别单一多为酵母菌、曲霉菌等真菌类菌株且对CGs 脱毒率较低；第二，工程改造菌虽然对亚麻籽的脱毒率高但又非农业农村部允许添加在饲料中的微生物，其安全性得不到保障；第三，先前研究关注CGs 脱除较多而对亚麻籽饼粕中其他营养成分变化关注较少。因此，试验旨在筛选出CGs脱毒率高同时又能改善亚麻籽饼营养组成的安全菌株，并通过发酵试验探究其发酵处理亚麻籽饼的效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 亚麻籽饼：购自呼和浩特市蒙谷香生物科技有限公司。

1.1.2 瘤胃液：采自中国农业科学院南口中试基地“杜泊羊×小尾寒羊”的二元杂交绵羊，该绵羊装有永久瘤胃瘘管并饲喂正常饲草，瘤胃液保存于4 ℃冰箱中。

1.1.3 好氧发酵袋：由中国农业科学院饲料研究所单胃动物饲料创新团队提供。

1.1.4 培养基

①细菌筛选固体培养基（七叶苷-LB 固体培养基）：酵母提取物0.5 g、琼脂粉1.5 g、蛋白胨1 g、氯化钠1 g、七叶苷0.05 g、柠檬酸铁0.01 g、蒸馏水100 ml，121 ℃灭菌20 min。

②细菌基础固体培养基（LB 固体培养基）：酵母提取物0.5 g、琼脂粉1.5 g、蛋白胨1 g、氯化钠1 g、蒸馏水100 ml，121 ℃灭菌20 min。

③细菌基础液体培养基（LB 液体培养基）：酵母提取物0.5 g、蛋白胨1 g、氯化钠1 g、蒸馏水100 ml，121 ℃灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 CGs降解菌的初筛

采用七叶苷柠檬酸铁板法[11-12]进行菌株的初筛，具体步骤如下：

用4层无菌纱布将绵羊瘤胃液过滤，吸取1 ml滤液用无菌水分别稀释至10-1、10-2、10-3、10-4倍，分别吸取不同稀释倍数的滤液20 μl涂布于LB固体平板上，每个倍数的稀释液涂布2个LB固体平板，其中1个平板置于厌氧袋中，于37 ℃生化培养箱中培养72 h，待长出菌落后, 挑取出现变色圈的菌落进行划线、分离，按照上述方法反复划线、分离，直至出现单一菌落。将出现变色圈的菌株纯化后，分别接种于10 ml LB液体培养基中，培养24 h后,吸取10 μl培养液滴于筛选平板的中央，每株菌做三个重复，在培养48 h后用刻度尺分别测量变色圈直径（d1）和菌落直径（d2）的大小，以d1/d2的结果为指标，选取比值较大的菌株作为初筛菌株并保藏[13]。

1.2.2 CGs降解菌的复筛

将初筛的4株菌扩大培养后，分别取3 ml菌液于300 ml 烧杯中，加入21 ml 的无菌蒸馏水，混匀，加入30 g 亚麻籽饼粉，搅拌均匀，封瓶口膜封口，置于37 ℃培养箱中72 h，每个处理设3个重复。发酵结束后，发酵料自然风干。测定各试验样品CGs 含量，选取CGs降解效果最佳株菌进行鉴定。

1.2.3 菌株鉴定

观察菌株菌落形态并参照《常见细菌系统鉴定手册》[14]对筛选的菌株进行初步鉴定，菌株培养48 h 后观察单菌落的颜色、形状、大小、粗糙程度、边缘等。并将菌株委托于北京美吉桑格生物医药科技有限公司进行菌株16S rDNA测定。

1.2.4 菌株生长曲线测定

挑取枯草芽孢杆菌单菌落一环于10 ml 液体LB培养基中并置于37 ℃恒温摇床，24 h 后取上述培养液1 ml于100 ml液体LB培养基中，37 ℃恒温摇床培养36 h，每2 h取样1次，于紫外分光光度计600 nm处测定OD值,最后绘制OD值随时间变化曲线图。

1.2.5 枯草芽孢杆菌发酵处理亚麻籽饼

取1 kg 亚麻籽饼作为唯一发酵底物于好氧发酵袋进行发酵试验，发酵菌株为枯草芽孢杆菌发酵，发酵条件为：时间72 h、温度39 ℃、料水比1:0.7、接种量4%。未处理组为亚麻籽饼原料不进行任何处理。每个处理三个重复，处理后的样品经自然风干后测定CGs 含量并计算CGs 的脱毒率，同时测定干物质、粗蛋白质、多肽、粗纤维和粗脂肪含量。

CGs 脱毒率（%）=（未处理组CGs 含量-发酵后CGs含量）/未处理组CGs含量×100

1.3 测定指标及方法

参考GB/T 13084—2006的比色法测定CGs含量，称取10 g（精确到0.001 g）样品于500 ml 水蒸气蒸馏装置中,加水约200 ml，塞严瓶口，在室温放置4 h，加入20 ml乙酸锌溶液和2.0 g酒石酸，迅速连接好蒸馏装置,将冷凝管下端插入盛有10 ml 20 g/l氢氧化钠溶液的100 ml锥形瓶液面下。进行水蒸气蒸馏,收集蒸馏液约100 ml 时，取下锥形瓶，将锥形瓶收集的蒸馏液完全转移至250 ml 容量瓶中，用水定容至刻度线。量取10 ml容量瓶溶液置于25 ml比色管中，作为试样溶液。试样溶液中加1 ml 10 g/l氢氧化钠溶液和1滴酚酞指示液，用乙酸溶液缓慢调至红色褪去，加5 ml磷酸盐缓溶液，37 ℃恒温水浴锅中保温10 min，分别加入0.25 ml 氯胺T 溶液，加塞振荡混合均匀，放置5 min。分别加入5 ml 异烟酸-吡唑酮溶液,加水至25 ml，混匀。37 ℃恒温水浴锅中放置40 min，用2 cm比色杯，以零管调节零点，于波长638 nm处测吸光度。

采用杜马斯全自动定氮仪测定粗蛋白质含量；采用滤袋法测定粗纤维含量；采用索氏抽提法测定粗脂肪含量；参照GB/T 22492—2008大豆肽粉的测定方法测定多肽含量；干物质(dry matter，DM）含量的测定方法参照GB/T 6435—2014,采用鼓风干燥箱测定。以上所有测定指标结果均以绝干质量为基础表示。

1.4 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 20.0软件中的one-way ANO⁃VA 过程进行方差检验，Duncan's 法进行各组间平均值的多重比较，以P<0.05 作为差异显著性判断标准。试验结果均以“平均值±标准误”表示。

2 结果

2.1 菌株初筛与复筛

初筛结果如表1所示，从绵羊瘤胃液中分离得到9株出现黑色圈的菌株，其中有4 株菌（L1、L2、L3、L4）d1/d2的结果大于等于1.5。复筛结果如表2 所示，菌株L4的脱毒效果显著高于其他菌株（P<0.05）。

表1 9株目的菌培养48 h变色圈直径与菌落直径比值

表2 4株初筛菌发酵处理亚麻籽饼脱毒效果

2.2 菌株鉴定

将复筛的菌株L4在LB 平板上培养48 h，观察到菌株L4 形成圆形菌落，边缘不规则，表面干燥粗糙。在显微镜下观察到菌株L4 的菌体均为杆状，革兰氏染色为阳性。16S rDNA 菌株鉴定结果表明：菌株L4属于芽孢杆菌属，与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain）KY652941.1 同源性达100%，CGMCC 登记号为18229，由此确定L4 为枯草芽孢杆菌，且枯草芽孢杆菌属于饲料添加剂品种目录中允许使用的菌株[15]，最终选用L4枯草芽孢杆菌为发酵菌株。

2.3 菌株生长曲线

如图1所示，枯草芽孢杆菌经过短暂的生长缓慢期，在2 h 到24 h 处于生长对数期，在24 h 达到最大生长浓度，然后进入平台期。因此，在后续发酵试验中应选取培养24 h的菌液作为发酵种子液。

图1 枯草芽孢杆菌的生长曲线

2.4 枯草芽孢杆菌发酵处理亚麻籽饼对营养组成的影响

由表3 可知，枯草芽孢杆菌发酵处理亚麻籽饼CGs 脱毒率超过90%，亚麻籽饼营养组成得到改善。粗蛋白质含量由(36.79±0.37)%显著提高到(39.43±0.53)%（P<0.05），多肽含量由(1.65±0.06)%显著提高到(4.41±0.03)%（P<0.05），粗脂肪含量由(8.81±0.09)%显著提高到(9.55±0.07)%（P<0.05），粗纤维含量变化不显著（P>0.05）。

表3 发酵处理亚麻籽饼对营养组成的影响

3 讨论

3.1 CGs脱毒菌株的筛选及其脱毒机理

据报道[16-18]，已从反刍动物瘤胃中筛选出多种需氧型芽孢杆菌，如浸麻芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌。本研究筛选的CGs脱毒菌株为枯草芽孢杆菌，属于芽孢杆菌科芽孢杆菌属为需氧菌，反刍动物瘤胃内容物含氧量很少[19]，需氧型的芽孢杆菌不能长期在瘤胃中生存繁殖，因此推测瘤胃中这些需氧型芽孢杆菌可能随饲草等进入反刍动物瘤胃并暂时存留。亚麻籽中CGs 主要为β-龙胆二糖丙酮氰醇（linustatin，LN）和β-龙胆二糖甲乙酮氰醇（neolinustatin,NN）[20]，LN 和NN 均可被β-葡萄糖苷酶水解为氰醇和葡萄糖，氰醇在中性和碱性环境中非常不稳定能够自发分解（羟腈裂解酶可加速这一过程）产生酮化合物和HCN[21-22]。研究初筛结果表明枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain）KY652941.1 产β-葡萄糖苷酶能力较强，复筛结果表明该株枯草芽孢杆菌能以亚麻籽饼为唯一底物生长，因此在枯草芽孢杆菌分泌的各种酶作用下，亚麻籽饼的结构被破坏，CGs 与β-葡萄糖苷酶充分接触而发生分解，产生的HCN 易挥发，从而达到亚麻籽饼脱毒。

3.2 不同发酵菌株降解亚麻籽饼CGs能力比较

微生物发酵处理亚麻籽饼降解生氰糖苷的研究报道较少，发酵菌株不同降解生氰糖苷能力也不同，梅莺等[6]研究表明枯草芽孢杆菌(Bacillus sublitis)ACCC01183 发酵处理亚麻籽饼CGs 脱毒率为73.28%，本研究筛选出的枯草芽孢杆菌（Bacillus sub⁃tilis strain）KY652941.1 发酵处理亚麻籽饼CGs 脱毒率超过90%；Li 等[23]研究表明菌株Lichtheimia ramose发酵处理亚麻籽饼CGs 脱毒率为89%；翟双双[9]研究表明产朊假丝酵母（Candida utilis）GIM 2.148 和黑曲霉（Aspergillus niger）GIM 3.576 混合发酵处理亚麻籽饼CGs脱毒率为75.94%；冯爱娟等[10]用重组毕赤酵母（GS115-Ch-Glu）发酵处理亚麻籽CGs 脱毒率达97.00%。综上所述，与其他发酵菌株相比，本研究筛选出的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain）KY652941.1发酵处理亚麻籽饼CGs脱毒率较高，是目前已知CGs脱毒率最高的天然菌株。

3.3 发酵处理改善亚麻籽饼营养组成的机理

研究表明[10-11，24-25]，经微生物发酵处理，可显著提高亚麻籽饼粕、菜籽饼粕、棉粕等杂粕的粗蛋白质含量，这是由于发酵过程中碳水化合物等底物的消耗使得粗蛋白质在发酵料中百分含量增加。同时在发酵过程中，枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶可将亚麻籽饼中部分大分子蛋白质分解为易被动物消化吸收的多肽。本研究中所用的枯草芽孢杆菌能够产生β-葡萄糖苷酶，而该酶又是纤维素酶系的重要组成成分在纤维素降解方面有着重要的作用，可以把纤维二糖水解成葡萄糖[26-27]因此该株枯草芽孢杆菌可能对粗纤维具有一定的降解能力，发酵亚麻籽饼的过程中部分粗纤维被降解，但是底物的消耗并未使粗纤维的百分含量在发酵料中增加。亚麻籽饼经枯草芽孢杆菌发酵处理后，降低了抗营养因子-CGs含量，显著提高了粗蛋白质、多肽等的含量，提高了其营养价值。研究表明[28-29]，亚麻籽饼粕在反刍动物日粮中最高添加量为20%，在猪日粮中适宜添加量为8%～10%，日粮中添加5%亚麻籽饼显著降低肉鸡生长性能，本研究发酵处理能提高亚麻籽饼营养价值，但能否提高其在动物饲粮中的添加量还需进一步研究。

4 结论

①本研究筛选出一株高效降解CGs 的天然菌株，经鉴定此菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain）KY652941.1。

②所筛选枯草芽孢杆菌发酵处理亚麻籽饼CGs脱毒率超过90%。

③所筛选枯草芽孢杆菌发酵处理亚麻籽饼改善了其营养组成显著提高粗蛋白质、多肽含量和粗脂肪含量，极大地提高了亚麻籽饼的营养价值。