间充质干细胞在卵巢早衰治疗中的应用进展

赵 琳

(南京医科大学附属苏州科技城医院 妇产科，江苏 苏州 215000)

女性在40岁以前出现的卵巢功能减退称为早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)，其终末阶段为卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)，主要特征为闭经、FSH>40 IU/L、雌激素水平降低并伴有不同程度的围绝经期症状以及不孕。30～40岁女性发病率约为1%左右，近年来呈上升趋势[1]。其病因多种多样，其中37%的POF因手术及放化疗损伤等医源性因素引起，而遗传、代谢、免疫、环境及氧化应激等也与该病相关，不良生活方式、工作方式也为其诱因。其主要的治疗方法为激素替代治疗(hormone replacement therapy，HRT)，然而HRT仅能缓解围绝经期症状，无法从根本上挽救早衰的卵巢，且长期外源性激素的作用下可增加血栓性疾病及肿瘤等相关疾病的发病率。而对于不孕的患者目前只能通过冻存卵细胞、“赠卵”、胚胎移植等方式解决生育问题。近年来随着再生医学研究快速发展，干细胞作为一类具有多向分化潜能和自我复制能力强的原始未分化细胞，自上个世纪被发现之后逐渐走入大家的视野。由于干细胞的全能特性，干细胞移植在包括不孕症等多种复杂疾病的治疗中有着广阔的应用前景。干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞，因前者来源困难且存在较多的伦理争议，其相关研究受到极大限制。而间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)作为一种成体干细胞不仅有干细胞的特性且来源广泛，伦理争议较少，在POF的治疗上有着巨大的潜力。本文主要对MSCs治疗POF的研究现状进行综述。

1 MSCs概述

MSCs作为最早在骨髓中被发现的一种成体干细胞，起源于中胚层，几乎在全身结缔组织和器官间质中均有分布[2]。它不仅保持着干细胞多向分化的潜能，而且免疫原性低，向受损组织迁移能力强，伦理争议较小，因此最早被应用于临床研究，现已广泛用于医学生物工程。目前， MSCs已经用于治疗血液系统、神经系统、运动系统、心血管系统以及皮肤等多种系统的相关疾病，疗效颇佳[3]。基于这种基础， MSCs用于包括POF在内的生殖系统疾病的基础及临床研究也在有条不紊的开展中，并证实了MSCs的有效性。研究用于治疗POF的MSCs主要包括骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs)、脐带间充质干细胞 (umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)、胎盘间充质干细胞(placental mesenchymal stem cells，PMSCs)、羊膜间充质干细胞(amniotic mesenchymal stem cells，AMSCs)、羊水间充质干细胞(amniotic fluid mesenchymal stem cells，AFMSCs)、经血间充质干细胞(menstrual stem cells, MenSCs)、脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells，ADMSCs)等胎儿来源或是成体来源的MSCs，并且已经取得令人瞩目的结果。尽管不同来源的MSCs可能有不同的生物学特性，但总的来说它们治疗POF的机制可以总结为以下几点：(1)MSCs具有“归巢”作用；(2)MSCs能直接分化为颗粒细胞或者是抑制其凋亡，促进其再生，改善其功能；(3)MSCs可诱导、分化为原始生殖细胞；(4)MSCs可促进卵巢血管的生成；(5)MSCs有免疫调节作用[4]；(6)MSCs能降低氧化应激反应[5]。这些直接或间接的作用使MSCs治疗POF成为可能。

2 MSCs与颗粒细胞

卵巢颗粒细胞(ovarian granulosa cells，OGCs)是卵巢主要的功能细胞，它通过自分泌和旁分泌的机制在卵泡的各个阶段起到举足轻重的作用。各种原因造成的颗粒细胞异常均能够导致激素分泌异常、卵泡发育障碍甚至引起卵泡闭锁。研究表明化疗可通过损害颗粒细胞DNA，激活颗粒细胞凋亡通路等机制促进颗粒细胞凋亡从而导致POF的发生[6]。因此认为，抑制颗粒细胞凋亡，促进颗粒细胞生成或者增强颗粒细胞功能能够有效预防POF，而MSCs的多向分化潜能可能可以实现这种假设。10余年前国外学者通过体外培养发现，在特定培养条件下颗粒细胞分泌功能可降低并能够产生干细胞的标志物，分化形成神经细胞、骨和软骨等各项不同组织的细胞，表明颗粒细胞存在干细胞的潜力[7]。此后，大量研究均表明颗粒细胞与包括BMSCs、UCMSCs在内的多种MSCs均存在大量相同或相似的表面标志物[8-9]。一项动物研究表明，原位注射MenSCs后，MenSCs可被诱导分化为卵巢颗粒细胞，POF小鼠的卵巢重量、雌激素水平和正常卵泡的数量增加，FSH水平降低，卵巢功能明显好转[10]。另一项相似的动物研究表明，MenSCs治疗后，POF小鼠卵巢功能明显改善，通过标记MenSCs，发现该细胞主要定位在卵泡周围颗粒细胞层，故认为 MenSCs可能被诱导分化为卵巢颗粒细胞，从而起到治疗POF的作用[11]。由此推测颗粒细胞与MSCs之间在某种条件下可能可以相互转化，深入的研究仍有待进一步探索。Fu等[12]研究发现，体外将化学药物损伤的颗粒细胞与BMSCs共培养时，BMSCs可以抑制颗粒细胞凋亡，上调Bcl2蛋白的表达，而将BMSCs移植入接受环磷酰胺注射的POF大鼠的卵巢中，通过动情周期变化和性激素水平评估卵巢功能，并通过TUNEL分析颗粒细胞凋亡，得到同样结果，BMSCs可以通过抑制颗粒细胞凋亡改善卵巢功能。通过建立体外损伤模型，观察到UMSCs外泌体可与损伤的OGCs结合，从而加速OGCs从顺铂体外诱导的应激和凋亡中恢复，而这种机制可能与microRNAs 27，28相关[13]。与之相似，另一项羊水干细胞的实验表明颗粒细胞凋亡的抑制可能与外泌体携带的miR-146a和miR-10a相关[14]。由此可见MSCs能通过抑制颗粒细胞的凋亡来改善POF，其机制可能与外泌体相关。有学者将AMSCs与自然衰老的颗粒细胞共培养，结果颗粒细胞增殖率明显增加，同时细胞表面 AMH、FSHR、FOXL2、CYP19A1的表达明显增加，提示AMSCs 可能通过改善颗粒细胞的功能，促进颗粒细胞增殖阻止卵巢功能的减退[15]。另一项研究表明，AMSC高表达转录因子OCT4和Nanog，能通过JAK/STAT信号通路提高相关生长因子和趋化因子的表达，促进颗粒细胞增殖，恢复损伤卵巢功能[16]。因此，MSCs可通过各种途径改善颗粒细胞功能从而达到恢复卵巢功能及治疗POF的作用，可能与MSCs的多向分化潜能，外泌体的作用及自分泌或旁分泌能力相关，今后需在全面评估其安全性及可行性的基础上，深入探讨MSCs恢复颗粒细胞功能作用机制。

3 MSCs与原始生殖细胞

研究表明，MSCs能通过多种途径激活原始生殖细胞，从而调节卵巢功能达到治疗POF的目的，而其具体机制尚不清晰。既往动物研究表明，ADMSCs及UCMSCs可以直接被诱导分化为雄性原始生殖细胞，而CD61(整合素β3)可以通过依赖TGF-β途径的活化来促进这种分化[17]。由此可推测MSCs也可能有直接分化为卵母细胞的潜力。相关研究也证实了MSCs可作为供体细胞扩增卵母细胞[18]。与之相反，大量研究表明MSCs并不能直接分化为卵母细胞而是定位于卵巢基质并分泌各种细胞因子，通过旁分泌途径而改善卵巢储备功能，而能否恢复生育力更有待于进一步的研究[19]。故可认为MSCs的旁分泌效应是增加卵母细胞作用的关键，而MSCs是否能直接分化为卵母细胞尚不能得到确切的结论。近期国内一项研究将小鼠分为对照组、POF组与MenSCs移植组，观察其成熟卵子数目，采用分子生物学方法分析各相关蛋白的表达，结果表明MenSCs可旁分泌胰岛素样生长因子1(IGF-1),通过与其受体结合并下调靶器官内生长因子受体结合蛋白10的表达,激活PI3K-AKT-FOXO3a信号通路，使FOXO3a磷酸化水平增高从而促进原始卵泡的发育[20]。为探讨UCMSCs对卵巢早衰家兔治疗作用及其内在机制，学者将POF家兔按是否使用UCMSCs分为治疗组和对照组，比较激素变化及相关蛋白表达水平，结果表明UCMSCs能通过上调CYR61和CTGF的表达从而激活休眠的卵泡，改善卵巢功能[21]。另外还有研究表明AMSCs能通过上调相关干细胞功能蛋白来减少卵巢生殖干细胞的消耗，促进其分化为原始卵泡，改善微环境从而恢复卵巢功能[22]。总之，MSCs可通过改善生殖细胞的发育和减少原始生殖干细胞的消耗恢复卵巢功能，而其具体机制仍有待进一步探讨。

4 MSCs与卵巢血管

卵巢复杂血管系统的建立与重塑是卵巢发育及维持功能的基础。卵泡和/或黄体可通过卵巢血管获取营养支持，运输相关激素到靶器官[23]。血管系统受损可导致卵巢功能异常，造成一系列相关疾病。有证据表明化疗药物可以引起皮质纤维化和血管损伤，而这种损伤与POF相关。有学者通过标记BMSCs特异标志物观察其在卵巢中分布情况，发现BMSCs主要分布在受损卵巢的血管中[24]。由此推断BMSCs可能作用于卵巢血管而发挥作用。在此基础上，一项有关MenSCs的研究表明其可通过分泌VEGF、IGF-1、G-CSF、HGF等相关细胞因子促进卵巢血管再生，减轻间质纤维化，从而改善卵巢功能[25]。微泡(microvesicles，MVs)作为一种携带细胞来源的膜和细胞质成分的直径<1 μm的小泡，可以通过表面表达的配体和表面受体将mRNA、蛋白质和脂质转移到靶细胞，从而影响靶细胞的表型和功能[26-27]。MSCs分泌的MVs可能通过各种方式修复受损组织。一项有关UCMSC-MVs移植治疗POI小鼠的研究表明，UCMSC-MVs携带的相关蛋白可通过激活PI3K/AKT信号途径诱导血管生成，从而改善卵巢功能[28]。而这项研究发现MSC-MVs移植可作为一种新的无细胞治疗方法，为POI的治疗提供一种新的思路。总之，MSCs可通过各种方式诱导卵巢血管生成，修复受损的卵巢，从而改善卵巢功能。

5 MSCs与免疫调节

免疫异常是造成POF的原因之一。10余年前已有报道MSCs在体外和体内对几乎所有类型的免疫细胞都有调节作用[29-31]。众所周知，MSCs可通过抑制淋巴细胞激活和增殖，抑制促炎细胞因子的分泌，抑制抗原呈递细胞的功能以及激活调节性T(regulatory T cells，Treg)和B(regulatory B cells，Breg)细胞来发挥免疫调节作用[32]。近年来研究发现POF存在T细胞亚群的比例失常，主要表现为Treg数量减少，及CD4+/CD8+T淋巴细胞比值下降[32-33]。而ADMSCs联合雌激素可促进 POI 患者外周血中Treg细胞的分化，从而改善卵巢功能[34]。既往研究表明MSCs可通过可溶性介质的刺激、细胞-细胞间相互作用和抗原呈递细胞的作用来调节Treg细胞。相关机制可能为在炎性环境下，MSCs分泌TGF-β1，PGE2和IDO等细胞因子，以促进幼稚T细胞向Foxp3+Treg细胞的分化。MSC也可以通过CD54和C11a / CD18直接接触而与Th17细胞相互作用，在PGE2的帮助下分化的Th17细胞可转化为功能性Foxp3+Treg细胞，MSCs还可通过抗原呈递细胞增加IL-10的分泌，从而诱导Tr1细胞分化[35]。近期，为研究MSCs对免疫调节的机制，有学者在用MSCs治疗的POF小鼠中加入PI3K/Akt抑制剂以观察其对卵巢功能恢复和免疫调节的作用，结果发现加入PI3K/Akt抑制剂后其卵巢功能明显下降，Th17/Tc17和Th17/Treg细胞比率增加，故可以表明MSCs可通过PI3K/Akt信号途径参与Th17/Tc17和Th17/Treg细胞的调节从而调节免疫系统，恢复卵巢功能[4]。综上所述，MSCs主要通过调节Treg细胞来参与免疫系统的调节从而改善POF患者的卵巢功能，其分子机制可能与炎性因子对免疫细胞的调节以及PI3K/Akt通路的激活相关，由于其相关研究较少，具体的分子机制有待进一步研究。

6 MSCs与氧化应激反应

氧化应激反应(oxidative stress，OS)是由于细胞内产生的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和活性氮簇(reactive nitrogen species，RNS)产生过多，造成氧化系统与抗氧化系统失衡的一种现象，它与组织损伤与衰老密切相关，可能是造成POF的原因之一。既往研究表明MSCs可以通过分泌HGF、IL-6、IL-8、VEGF、BDNF、LIF 等相关细胞因子及外泌体，激活FOXO、NOQ1/MAPK、PI3K/Akt、Nrf2-ARE等相关通路，增加抗氧化作用酶的生成，抑制ROS产生，从而起到抗氧化应激的作用，由此改善卵巢功能[36]。除此之外，近来一项针对POF模型大鼠的研究表明MSCs移植还可激活SIRT1/PGC1-α/Nrf2通路，起到抗氧化，修复卵巢的作用[37]。大量研究证明，褪黑素能与褪黑素膜受体(MT)结合起到抗氧化作用并介导细胞保护。为探讨MSCs的抗氧化作用是否还与MT相关，有学者通过对胎肝间充质干细胞(fetal liver mesenchymal stem cells，fMSCs)的研究发现其在mRNA和蛋白质水平上调MT1、JNK1、PCNA和AMPK，抗氧化作用加强，而敲除MT1基因后发现JNK1、PCNA、AMPK蛋白表达下降，抗氧化作用受抑，故可认为fMSCs抗氧化作用与MT1相关，而MT1也可作为用以治疗POF的另一靶点[38]。综上所述，我们不难得出MSCs可能通过自分泌或旁分泌作用分泌各种细胞因子或是产生外泌体或是靶向作用于MT1激活相关信号通路，抑制ROS的产生，从而恢复“氧化-抗氧化”系统的平衡，修复损伤的卵巢，起到治疗POF的作用。

7 MSCs的归巢与增强MSCs作用的因素

归巢是指干细胞在多种因素的刺激下迁移到损伤组织并通过各种机制发挥作用，从而促进受损组织的恢复过程。研究发现用环磷酰胺诱导的POF小鼠体内TNF-α水平较正常小鼠升高，而这种细胞因子可趋化BMSCs向受损的卵巢迁移，促进MSCs的归巢[39]，研究证明趋化因子家族及其受体与之密切相关。其中基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF1)及其受体(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)组成的SDF1/CXCR4轴在MSCs的归巢作用中起到重要作用。该通路的激活不仅可以促进MSCs的归巢，还可以抑制其凋亡，同时刺激bFGF和VEGF的分泌，增强MSCs的作用，促进卵巢功能的恢复[40]。由此推测外界添加趋化因子有可能促进MSCs的归巢，而这种归巢作用是MSCs作用的基础。既往研究表明，热休克预处理能提高干细胞对缺血再灌注损伤的修复率。热休克预处理过的MSCs对药物性POF具有更强的修复作用，而其机制可能与MAPK通路激活有关[41]。众所周知，低氧刺激最开始对细胞活性有抑制作用，甚至会促进细胞的凋亡，而此后又反而会激活细胞活力，促进细胞因子的分泌，增强其迁移能力[19]。由于这种特性，推测低氧预处理可能会加强MSCs的作用。为验证这一猜测有学者将低氧预处理后的UMSCs与正常UMSCs分别移入POI小鼠，观察卵巢功能，结果表明无论是否经过低氧预处理，用UMSCs治疗的小鼠卵巢功能均有明显的改善，而低氧预处理后卵巢功能改善情况更为明显[42]。miR-21作为一种内源性非编码RNA，可通过调控靶基因来调节包括卵巢颗粒细胞在内的各种细胞的分化、增殖和凋亡。为研究过表达miR-21的BMSCs的作用是否能如愿增强，相关动物实验构建了添加miR-21的BMSCs (miR-21-BMSCs) 同时与正常BMSCs分别作用于POF小鼠，结果发现miR-21-BMSCs对POF小鼠的治疗效果明显加强，而这种作用可能与其调控靶基因PTEN、PDCD4密切相关[43]。

8 总 结

MSCs作为一种有多项分化潜能的成体干细胞在POF的治疗方面有巨大的潜力。不同来源的MSCs治疗POF有着相似的疗效，作用机制类似，总体可归纳为MSCs可归巢于卵巢，不仅可增加卵巢各级卵泡数，改善内分泌功能，还可增加受孕率。研究表明其主要通过作用于卵巢颗粒细胞、原始生殖细胞及卵巢血管等相关细胞和组织或是发挥其免疫作用和抗氧化应激作用而刺激卵巢功能的恢复，具体分子学机制还有待于进一步的探讨。热休克及低氧预处理或是增加miR-21的表达能够加强MSCs的作用，这种预处理或可为MSCs相关研究提供一定的借鉴作用。深入了解MSCs治疗POF的机制，评估其在人体中的安全性和有效性可为进一步临床研究打下基础。总之，MSCs不仅有望恢复POF患者的卵巢功能，更是为不孕患者带来了曙光，具有广阔的临床转化应用前景。