ctDNA在可切除结直肠癌肝转移中的应用

王真,刘燕文

(东南大学 医学院，江苏 南京 210009)

随着液体活检的发展，循环肿瘤DNA(ctDNA)在肿瘤的筛查、监测复发、治疗耐药、预后等方面具有应用价值。ctDNA由肿瘤细胞释放入血并且能保留其表观遗传学特征。结直肠癌最易发生转移的部位是肝脏[1]，结直肠癌肝转移切除与不切除生存率差异较大，但目前对于是否应该切除暂无统一的标准。作者拟就ctDNA在可切除结直肠癌肝转移中应用的研究进展作一综述。

1 可切除结直肠癌肝转移介绍

部分结直肠癌肝转移患者初始状态或经过转化治疗后，可以评估为可切除。根据2019年CSCO指南，目前镜下病理无残余(R0)切除仍是最重要的治疗手段，不可切除的则行姑息治疗。手术切除及不可切除的结直肠癌肝转移患者的5年生存率分别为42%和9%，10年生存率为25%和4%[2]，可见对于可切除患者应实行以手术为核心的综合治疗模式。结直肠癌肝转移术前评估标准包括两个维度：(1) 外科技术维度，足够的残留肝脏体积，手术切缘达到R0要求[2]；(2) 肿瘤生物学维度，从复发风险评分(CRS)、肿瘤病理信息、免疫组化、左右半结肠、化疗敏感性等方面评估。但仍有部分患者R0切除术后出现早期复发，无病生存期(DFS)较短。同时手术切除及术后恢复都是对机体机能的消耗，将会影响患者后续生存质量及治疗耐受性。因此，需要更多术前评估指标，筛选手术优势人群，避免不必要的肝切除手术。

术后通过评估样本的边缘来确定手术切除结直肠癌肝转移的根治性。外科手段的R0切除是达到无疾病状态(NED)的手段之一，但是对于微小病灶评估仍存在不足。精准评估术后的NED是目前的一个难点。术后监测手段主要为体检、肿瘤血清标志物癌胚抗原(CEA)检测及胸腹盆的增强CT。但是目前血清肿瘤标志物存在敏感性较低的缺点；影像学检查存在滞后性，也容易漏扫微小病灶。因此急切需要更多的评价指标帮助筛选手术患者以及进行术后评估监测，弥补现有监测手段的不足。液体活检具有无创性、敏感性和动态性等优势，有解决部分现存问题的潜力。其中ctDNA尤其值得关注，也是液体活检目前的研究热点。有多个研究表明ctDNA在结直肠癌早期诊断、监测术后早期复发、监测治疗反应、治疗耐药、提供预后信息等方面具有应用价值[3]。ctDNA能否在结直肠癌肝转移中成为一个可靠的预测指标值得关注。

2 ctDNA简介

ctDNA占循环无细胞DNA(cfDNA)总量的一小部分，是肿瘤细胞释放到血流中的150～200个碱基对片段，保留了表观遗传特征，并携带可在外周血中检测到的肿瘤特异性突变[4]。ctDNA半衰期短，通常小于1 h，可以动态监测肿瘤的变化[5]。ctDNA可来源于肿瘤原发组织、转移灶和循环肿瘤细胞。目前ctDNA主要的监测方法有靶向监测和非靶向监测。靶向监测如ddPCR，可以检测同一样本的多个突变，灵敏度高(0.05%～0.001%)，但其多路复用能力仅限于检测5～10个不同的目标序列[6]。非靶向监测如下一代测序(NGS)，传统的NGS的灵敏度为2%～5%，通过大规模并行测序可以同时检测数百种分子异常，优化的NGS敏感度已提高[6]。ctDNA的敏感性要远高于CEA，并能比影像资料更早预测治疗反应及疾病复发。Young等[7]提出甲基化的ctDNA敏感性是CEA的2倍，在一项荟萃研究[8]中，ctDNA中Septin9敏感性远超血清肿瘤标志物，特异性无明显差异。目前ctDNA部分应用已进入市场阶段。ctDNA可以指导晚期肿瘤患者的药物选择，如检查非小细胞肺癌T790m突变、指导靶向用药。Septin9基因甲基化可应用于结直肠癌的早期筛选中。

3 液体活检ctDNA与组织活检的一致性

组织活检提示RAS和BRAF野生型的晚期结直肠癌患者Ⅰ级推荐化疗加抗表皮生长因子受体(EGFR)治疗[2]。RAS、BRAF基因有助于监测耐药、提供用药指导，同时它们也有预测预后的作用[9]。因此动态监测基因变化尤为重要，但组织活检创伤大且较难多次获得，而外周血ctDNA容易获得。液体活检与组织活检相关性的评估很有必要。

Thierry等[10]对106例结直肠癌患者使用金标准组织活检及定量PCR监测外周血ctDNA，结果发现BRAF V600E突变的特异性和敏感性均为100%，KRAS突变特异性为98%，敏感性为92%，一致性值为96%。Bachet等[11]研究发现，与肿瘤组织中的RAS状态相比，仅使用NGS的准确率为83%，使用NGS加甲基化生物标志物分析的准确率为93%。在肝转移患者中，两种检查联合使用的准确率达到96%。目前，多个研究显示ctDNA检测到的突变与组织活检突变的一致性较高[12- 13]。2019年在一项对结直肠癌KRAS突变与组织一致性的荟萃分析中合并的敏感性、特异性分别为63.7%、94.3%，外周血KRAS突变在特异性方面具有足够的诊断效能[14]。

在一项关于肝周血液和外周血循环肿瘤细胞(CTC)对结直肠癌肝转移切除术影响的研究中发现，肝周血液中CTC水平高与较短的DFS和较短的总生存期(OS)相关，而外周血CTC并不能预测预后。作者考虑外周血和肝周血液CTC的生物学可能存在差异[15]。Narayan等[16]进行了一项关于组织活检、外周血ctDNA以及肝周血液ctDNA的临床研究，检测TP53、APC突变，提出外周血可以反映肝周ctDNA的信号，与组织活检一致性高。

ctDNA与组织活检的一致性较高，为液体活检代替组织活检提供了可能，可以通过对外周血ctDNA定量或者定性的分析，达到指导用药和提供预后信息的目标。

4 外周血ctDNA在结直肠癌肝转移中的应用

4.1 外周血ctDNA对结直肠癌肝转移手术优势人群的筛选

目前术前评估的因素有手术技术、CRS等方面，但是部分结直肠癌肝转移患者术后很快出现复发，生存获益低，此类评价体系可能对他们并不适用。Kemeny等[17]提出阳性的手术切除边缘(R1)没有发现对无复发生存期(RFS)有预测作用，但是组织中监测到KRAS突变的结直肠癌肝转移患者的RFS降低。Margonis等[18]也得到类似结论，肝脏切除后存活率的差异是由于KRAS为野生型或突变型，而不是R0或R1切除。这强调了固有的癌症生物学特征的作用，而不是切除边缘。传统的评估方式存在争议，需要反映肿瘤特异性的新的生物标志物。同时组织活检KRAS突变与外周血ctDNA的一致性较高。此外，He等[19]发现术前ctDNA水平与结直肠癌肝转移的肿瘤负荷显著相关，对复发有预测作用。Bhangu等[20]提出ctDNA甲基化的Septin9和AIT 47与肿瘤体积相关，Septin9能够区分最终接受手术的患者。Lang等[21]也提出可以将RAS通路突变扩展到CRS中。在临床上术前ctDNA的检测可以成为参考因素，弥补传统评估方法的不足。

Bidard等[13]收集了潜在可切除肝转移患者治疗前、系统治疗1个月及肝手术前的外周血标本，ctDNA的评估局限于监测到KRAS2外显子突变的患者。基线时监测到ctDNA的患者，R0/R1的切除率较低；经过4周的全身治疗，ctDNA仍然可监测到的患者的R0/R1切除率低于未检测到的患者(36%vs85%)；术前监测到ctDNA的患者生存期较短。这表明该生物标志物可以帮助决定肝脏手术是否适合患者。

术前ctDNA阳性患者与阴性者相比，根治率低、生存获益较少，对后续化疗耐受也有不良影响。对此类患者需要谨慎选择手术，以便于患者获得最佳的治疗结局。

4.2 外周血ctDNA对结直肠癌转移瘤切除术后NED的评估

外科根治性即R0切除包括病变组织的完整切除，根治性手术是潜在达到NED的手段，能够有效提高患者5年生存率。术后ctDNA水平有望成为评估NED的新指标。Reinert等[22]发现1例患者术后外周血监测出ctDNA阳性，考虑手术并非根治性。Norcic等[23]提出对结直肠癌患者外周血中体细胞KRAS和BRAF突变的随访可能有助于评估疾病的手术清除。多个临床研究[24- 25]表明，ctDNA可以监测到术后的微小残余病灶。

Benesova等[26]在一项对47例转移性结直肠癌患者的研究中发现，28例R0切除患者术后ctDNA检测阴性26例(26/28,93%)。阳性患者中1例出现肝脏小转移，射频消融后患者继续显示ctDNA阳性，随后在术后6个月被诊断为疾病复发。另1例患者是根治术后6个月通过影像学方法观察到复发。这意味着ctDNA可以更加敏感地评估术后NED。Murray等[27]也发现术后血中ctDNA甲基化阳性的结直肠癌患者术后残余病灶及复发的风险增加。

NED是个动态的概念，随着液体活检等新技术的发展，对NED的评估会越来越准确。术后ctDNA阳性提示根治术后仍可能存在微小残留病灶。结合术后ctDNA水平可以更合理地选择术后辅助治疗的强度和时长以及制定术后随访的频率，推动个性化精准治疗的发展。

4.3 外周血ctDNA对结直肠癌肝转移术后随访的评估

根据CSCO指南，对于Ⅳ期转移瘤R0切除，Ⅰ级推荐随访/监测频率：前3年每3个月1次，然后6个月1次至5年,5年后1年1次。随访的内容包括体格检查、肿瘤指标CEA检查、每6～12个月的胸腹增强CT、盆腔增强核磁[2]。如前所述，CEA敏感性较低，影像学检查存在滞后性，ctDNA在术后监测中可以为早期发现复发转移提供依据。

在早期结直肠癌根治术后监测中，有研究表明ctDNA阳性者的复发率是阴性者的40倍，比影像早16.5个月预测复发[25]，另一项临床研究观察到ctDNA监测到复发平均先于放射学和临床证据3个月[28]。在一项230例早期结直肠癌标志物的前瞻性研究中，中位随访27个月，术后ctDNA阳性患者复发率为79%，ctDNA阴性患者复发率仅为9.8%[29]。术后ctDNA在Ⅱ期结直肠癌中提供残留疾病的直接证据，确定复发风险极高的患者，在Ⅲ期结直肠癌中有望成为RFS的预后因素[30]。

Scholer等[31]提出与CT成像相比ctDNA平均提前9.4个月检测到复发，23例肝转移患者中术后3个月ctDNA阳性者复发率为100%，阴性者复发率为50%，术后3个月的ctDNA监测是非常强的预测复发因素。Benesova等[26]监测47例结直肠癌肝转移术后患者，共22例出现复发，其中13例患者ctDNA、影像学及肿瘤标志物同时监测到复发。肿瘤标志物7次(32%)阴性，影像学检查无肿瘤6次(27%)，ctDNA全部检测到复发，其敏感性最高。4例患者(4/22,18%)仅用ctDNA检测肿瘤复发，影像学方法及肿瘤标志物均为阴性。

术后的动态监测可以提示预后信息，有助于更早监测肿瘤复发，为尽早实现临床干预创造条件。

4.4 外周血ctDNA在晚期结直肠癌的治疗评估及靶向药物“再挑战”中的应用

RAS基因野生型的晚期结直肠癌患者可以从抗EGFR治疗中获益。有趣的是组织中监测到RAS突变，但血浆中未监测到，依旧可以从抗EGFR治疗中获得生存益处[32]。但是治疗数月可发生耐药性，耐药性的产生与RAS通路突变的出现相关[33]。血浆ctDNA可以在影像进展发生前更早地监测到突变的存在[6]。由于RAS突变导致抗EGFR治疗病情进展的患者，可能在脱离抗EGFR治疗后重新获得敏感性。在一项抗EGFR“再挑战”治疗的临床研究中，患者缓解率为53.8%，中位无进展生存期为6.6个月[34]。Cremolini等[35]基于临床回顾性研究提出西妥昔单抗和伊立替康的再挑战策略可能对RAS和BRAF野生型晚期结直肠癌患者有效。组织二次活检创伤较大，通过分析血浆ctDNA中RAS突变可以选择适合“再挑战”的患者[36]。此外，血浆ctDNA早期的浓度变化可以预测一线或二线的化疗疗效[37]。

5 总结与展望

在晚期结直肠癌中外周血ctDNA与组织活检一致性较高，为液体活检提供了理论基础。目前关于术前ctDNA在结直肠癌肝转移手术中筛选优势人群的研究较少，文献局限于个例或KRAS突变的患者，术前ctDNA水平高与手术根治率低、生存期较短相关。目前也有研究表明，R0、R1切除对于预后可能无明显影响，反而是组织或者外周血中RAS突变影响预后。后续可以扩大样本的数量，筛选合适的评价指标。在术后监测和随访中，ctDNA阳性提示根治术后也可能存在残留病灶，存在快速复发的风险。术后随访监测ctDNA 也可以较现有检查方法更早、更敏感地提示复发。ctDNA有望在结直肠癌肝转移治疗中提供全程动态纵向的评估，实现肿瘤的个体化精准治疗，让患者获得更多的生存效益。

目前ctDNA的分离、检测还没有统一的标准，阳性的定义各个实验室存在差异。需要开展更多、范围更大的临床实验，制定统一的临床标准。同时ctDNA在血浆中含量低，在cfDNA占比仅0.2%左右，富集困难，检测费用较高，临床推广难度较大。有研究表明，在癌症患者中长cfDNA片段的浓度比例较高[37]，Iwai等[38]发现，长链cfDNA/β-球蛋白值升高在结直肠癌肝转移术后可以提示微小残留病灶，预测早期复发。在临床上部分ctDNA监测可以考虑由cfDNA代替，减少成本和处理时间，更容易推广。ctDNA价值的确定需要更大规模的研究和标准统一的流程，液体活检在肿瘤诊疗全过程拥有一个广阔的应用前景。