蜂房在乳癌术后方中应用的可行性研究

宋毕清，李海志

常州市中医医院，江苏常州213000

根据中国药典记载蜂房具有去腐、生肌、消炎、止痛、促进创口早期愈合的作用[1]。目前已知蜂房含有酚酸类、二苯基庚烷类、萜类、含氮类、黄酮类及酯类等化学物质，其药理作用有抗肿瘤、抗菌、免疫抑制等[2]。现有文献[3-4]认为蜂房所含蛋白具有对抗肿瘤作用。如实验发现蜂房蛋白NVP可能通过激活ERK信号通路从而抑制HepG2细胞增殖。动物在体研究[5]发现蜂房蛋白NVP能诱导白血病细胞凋亡。此外，蜂房对有机溶剂提取物也表现出显著抗肿瘤作用[6-7]。刘胜等[8]研究发现其含蜂房的乳癌术后方有明显降低乳腺癌术后复发转移的作用。研究表明[9]雌激素增加乳腺癌的发病风险，而乳癌术后方中蜂房是否具有雌激素目前尚无文献报道。该研究通过高效液相色谱法（HPLC法）检测蜂房和乳癌术后方中雌二醇、炔雌醇、雌酮和己烯雌酚这4种雌激素的有无来判断其是否适用于乳腺癌患者，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

LC-10AD型高效液相色谱仪、98-1-B电子调温电热套、SARTORIUS分析天平、KQ-300VDE型双频数控超声波清洗器、RE52CS-2旋转蒸发器、循环水式多用真空泵、十八烷基硅烷键合硅胶柱(岛津ODS 250 mm×4.6 mm,内径5μm)、雌二醇（100182-201205）、雌酮（100849-200501）、己烯雌酚（100033-201308）、炔雌醇（100052-200609）对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用）；甲醇、氯仿、乙腈（色谱纯）；娃哈哈纯净水。蜂房及乳癌术后方供试品：生黄芪30 g、党参12 g、白术9 g、茯苓12 g、南沙参15 g、枸杞子15 g、仙灵脾15 g、巴戟天12 g、肉苁蓉12 g、莪术30 g、蜂房12 g、石见穿30 g

1.2 样品处理

1.2.1 雌激素对照品 精密称取雌二醇、炔雌醇、雌酮和己烯雌酚对照品各5 mg分置50 mL容量瓶中,加甲醇适量,40 kHz超声处理15 min,放冷至室温,加甲醇至刻度,摇匀,作为单组分对照溶液。精密称取对照品各3 mg置于同一50 mL量瓶中,加甲醇适量,40 kHz超声处理15 min,放冷至室温,加甲醇至刻度,摇匀制得混合对照溶液。

1.2.2 蜂房供试品 蜂房单味药材粉碎，取0.5 g粗粉，以定性滤纸包裹，置于索氏提取器中，加入150 mL氯仿，回流提取5 h，提取液倒出，置于蒸发皿中挥干，用甲醇复溶，定容至10 mL，摇匀，取适量过0.45μm微孔滤膜，取续滤液制样，即得蜂房单味药材供试品。

1.2.3 乳癌术后方供试品 乳癌术后方称重，8倍水煎煮2次，过滤，合并滤液，滤液定容，浓缩至(生药)0.5 g/mL,取浓缩液1 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释，定容，摇匀后取适量过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，制样即得全方供试品。

1.3 HPLC法测定雌激素

色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶柱(岛津ODS 250 mm×4.6 mm，内径5μm);流动相:乙腈-水(50：50);检测波长:220 nm;柱温:30℃;进样量:20μL;理论板数按雌二醇计算,不低于2 000[10]。按上述色谱条件依法检测雌二醇、炔雌醇、雌酮、己烯雌酚4种雌激素。重复3次。取清晰稳定结果。

2 结果

2.1 对照品

根据混标对照品色谱图出峰时间分别为8.828、10.913、12.140、14.196 min，见图1。和雌二醇、炔雌醇、雌酮、己烯雌酚4种雌激素的单品对照品色谱图（见图2～5），记录对应的出峰时间分别为8.824、10.892、12.159、14.112 min。可见均有色谱峰与混标色谱图上的相对应，见表1。

图1 混标Figure 1 Mixed Standard

图2 雌二醇Figure 2 Estradiol

图3 炔雌醇Figure 3 Ethinyl estradiol

图4 雌酮Figure 4 Estrone

Figure 5己烯雌酚Figure5 Diethylstilbestrol

表1 对照品的出峰时间(min)Table 1 Peak time of reference substance(min)

2.2 样品

2.2.1 蜂房单味药材 索氏提取法提取后制样，其色谱图见图6 。可见色谱图中没有与对照品单品及混标4种雌激素对应的峰。

2.2.2 乳癌术后方水提样品 乳癌术后方水提样品色谱峰出峰时间分别为4.560、5.525、8.644 min，见图7。与对照品中4种雌激素无重叠峰。

图6 蜂房Figure 6 honeycomb

图7 乳癌术后方Figure 7 Recipe for breast cancer surgery

3 讨论

中药在我国乳腺癌术后的应用普遍。一项5 046名患者参与的上海乳腺癌生存研究显示97.2%的患者服用过膳食补充剂或中草药，76.8%的乳癌患者曾使用过中药，几乎所有的中药使用者都将中药作为癌症治疗的一部分，3/4的人报告[11]说中药用于增强免疫系统，约2/3的女性认为有效。迄今，无论是观察性研究还是临床试验都未能证实保健品能够改善癌症患者的预后，相反还可能增加死亡风险[12]。因此对膳食补充剂及中草药的使用安全性检测变得尤为重要。蜂胶、蜂王浆及蜂花粉等膳食补充剂具有雌激素样作用[13]。有试验显示0.8～4μg/mL蜂胶乙醇提取物和乙醚提取物明显增强雌激素依赖的人乳腺癌细胞MCF-7增值。并通过17β-雌二醇不同浓度的提取物与人雌激素受体结合的试验、酵母基雄激素及孕酮受体转录试验、未成熟雌性SD大鼠注射提取物试验阐明机理。结果提示蜂胶通过激活雌激素受体产生雌激素样作用[14]。而雌激素增加乳癌发病风险，故临床上禁用于乳癌术后患者，尤其是激素受体阳性乳腺癌患者。

该研究目的在于定性测定蜂房中是否含有雌激素，而非定量检测，故色谱峰出现即定义为有，而与峰面积无关。单品和混标的药品剂量不同，所配制液体浓度稍有差异，峰面积有高低并不影响定性结论。通过比较图2～5与图1色谱出峰时间得出混标色谱图中依次出现的色谱峰对应的雌激素为雌二醇、炔雌醇、雌酮、己烯雌酚，也说明混标并不影响各激素的色谱峰保留时间。蜂房单药水提样品和含蜂房的乳癌术后方在上述4种激素出现的保留时间内未出现任何峰，说明其不含这4类雌激素，也说明在乳癌术后方煎制过程中多药相互作用后也没有这4种雌激素的产生。而在其他时间内出现的峰与这4类雌激素无关，可能与蜂房及乳癌术后方所含的其他物质有关。所含物质有待进一步提取分析。

综上所述，该次研究未发现蜂房及前述乳癌术后方含有雌二醇、炔雌醇、雌酮和己烯雌酚这4类雌激素。患者可以使用蜂房及该方剂。蜂房及乳癌术后方的化学成分和药理活性还有待深入研究，今后有必要从化学单体分离、药理活性及作用机制、细胞实验、动物实验等方面展开系统研究，为蜂房及乳癌术后方等临床应用提供依据。