NPC患者转移相关lncRNAs表达分析

花 蕾，郑先斌,2，郭伟茜，陶振超，周 燕，杨丽萍，张洋洋，黄一凡，孙 斌，杨 婧，何 健，高 劲

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国常见的头颈部恶性肿瘤，2018年全球新发病例129 000例，中国占近一半，放射治疗是其主要治疗方式[1]。尽管近些年NPC临床诊疗水平不断提高，仍有20%～30%的患者发生远处转移，导致治疗失败，影响患者的整体生存率[2]。因此，NPC远处转移是临床面临的主要问题，鉴定NPC转移相关靶点尤为重要。

长链非编码RNAs(long non-coding RNAs，lncRNAs)是一类由大于200个核苷酸组成的RNAs。在细胞中，lncRNAs可以通过4种作用模式发挥生物学功能：① 调控下游基因转录；② 阻断分子的作用和信号通路；③ 将蛋白复合物定位到特定的DNA序列上；④ 起“中心平台”的作用[3-4]。目前，越来越多参与NPC发生发展的lncRNAs被发现。例如，HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)能够直接激活血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor-A，VEGFA)[5]的转录，调控基质金属蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP-9)和p21蛋白(protein 21，p21)的水平[6]，参与NPC的进展。lncRNA-LET通过调控MAPK/ERK 通路的表达谱[7]或多梳蛋白zeste基因增强子类同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)抑制[8]，影响NPC细胞增殖。然而，lncRNAs与NPC转移相关的潜在机制少有报道。该研究通过高通量测序筛选出在转移与非转移NPC患者外周血样本中差异表达的lncRNAs，并预测其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 标本收集选取2018年10月1日～2019年5月1日安徽医科大学附属省立医院西区(安徽省肿瘤医院)确诊为NPC的5例患者，所有患者均首次诊断为NPC。其中发生远处器官转移者3例，未发生转移者2例。抽取患者外周血标本5 ml，提取样本中上层血清，分装至无RNA酶小管，于液氮中冻存保存。所有研究对象均知情同意参加本项实验，且该过程经医院伦理委员会审查批准。

1.2 RNA提取和鉴定根据Takara RNAiso (Code No.9180/9109)说明书提取血清样品中的总RNA。提取完毕后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带检测总RNA完整性，并使用NanoDrop 1000分光光度计检测总RNA浓度及纯度。

1.3 文库构建测序文库构建采用每份样品中1～2 μg总RNA，先经过去除核糖体RNA处理，产物RNA用于下一步文库构建。基于dUTP的链特异性，将文库构建分为多个步骤，包括：将mRNA富集后的RNA进行片段化处理；通过逆转录合成第一链cDNA模板；加入dUTP形成互补链，合成双链cDNA；在各种聚合酶的作用下，使双链cDNA添加多聚A尾，且修复末端；Illumina特异性接头使用连接酶进行连接；最后经PCR扩增并纯化，得到RNA测序文库。

1.4 文库质检构建好的文库将使用Agilent 2100生物芯片分析系统进行质量检测，内容包括文库浓度、片段大小、是否含有接头等项目，并通过定量PCR方法进行文库的最终定量，根据定量结果及最终测序数据量的要求，混合不同样品的测序文库进入下一步测序流程。

1.5 上机测序混合处理完成的不同样品的测序文库，经过氢氧化钠溶液处理变性为单链DNA，稀释为特定浓度后，通过测序仪进行原位扩增，扩增出的片段末端使用测序仪检测150个循环。

1.6 测序数据分析和基因功能分析产生的测序数据通过测序质控后，将经过预处理过滤步骤产生的数据比对到参考基因组上，将比对结果进行统计分析后进行lncRNAs和转录本表达定量分析、lncRNAs表达水平分析、差异表达lncRNAs筛选、基因本体论(gene ontology，GO)、功能显著性富集分析(GO enrichment analysis)、京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路显著性富集分析等一系列分析，初步探讨NPC转移相关lncRNAs潜在机制。

1.7 统计学处理使用R软件中的Ballgown包进行样本表达水平的定量，以及组间的lncRNAs的差异表达分析。设定阈值为1.5倍差异，P<0.05，且组内FPKM均值≥0.5来筛选差异表达lncRNAs。

2 结果

2.1 文库质量评估及测序数据质量控制表1为lncRNAs在转移与非转移NPC中的表达谱，序列数和碱基数分别代表各样本的总序列及总碱基数。对每个样品的序列统计代表错误识别概率为0.1%的Q30，一般情况下认为Q30≥80%则认为测序质量合格。本研究所涉及样本测序数据Q30均≥90%，表明测序质量合格。

通过高通量测序，共鉴定出1 726条lncRNAs在5例NPC患者血液样本中表达，其中1 328条lncRNAs在NPC转移组中表达较高，398条lncRNAs在NPC转移组中表达较低。在转移组表达较高的lncRNAs中，有2条lncRNAs的表达量差异有统计学意义(Fold Change>1.5，P<0.05)，在转移组表达较低的lncRNAs中，有12条lncRNAs的表达量差异有统计学意义(Fold Change>1.5，P<0.05)，如表2所示，lncRNA ENST00000610778是表达差异较大的lncRNA，FC值为4 011.71，在转移组中含量低，非转移组含量高。

表1 测序数据量统计

表2 差异表达lncRNAs列表

2.2 lncRNAs相应基因的GO分析lncRNAs的功能往往与其相应周围编码蛋白的基因具有功能相似性，因此可以根据基因功能注释数据库GO对差异表达的lncRNAs周围编码基因按照功能进行分类及注释，GO注释内容包括：生物学过程(biological process, BP)、分子生物学功能(molecular function, MF)和细胞学组分(cellular components, CC)。经分析发现，差异lncRNAs的周围编码基因生物学过程主要集中于翻译、核糖体大亚基组装、SRP依赖的膜靶向共翻译蛋白、病毒转录、核转录mRNA分解代谢过程、翻译启动以及rRNA加工，涉及基因包括NACA、RPL3、RPL12，如图1A所示。分子生物学功能富集于核糖体结构成分，涉及基因包括RPL3、RPL12，如图1B所示。细胞学组分富集于胞质大核糖体亚基、黏着斑，涉及基因包括RPL3、RPL12，如图1C所示。

2.3 lncRNAs周围对应mRNAs的KEGG通路分析经过KEGG通路分析后发现，差异表达的lncRNAs对应同位基因在“核糖体”(Ribosome)通路富集。如图2、3所示。

图1 差异表达lncRNAs周围对应编码基因的GO注释气泡图

图2 差异表达lncRNAs对应周围编码基因的

3 讨论

人类基因组计划和DNA元件百科全书计划研究[3]结果显示，人类基因组中非编码的RNA占了大部分区域，其中的lncRNAs曾一度被认为是转录噪音。lncRNAs依据从基因组中被转录位置的不同，可被分为5大类：正义链、反义链、双向、内含子间、基因型[3-4]，这种位置关系很大程度上与lncRNAs功能有关。随着生物信息技术以及分子生物学的发展，发现多种lncRNAs在生命活动中发挥重要作用，包括肿瘤转移。例如，一项lncRNAs与NPC转移相关的研究表明，AFAP1-AS1在体外实验中通过调节肌动蛋白丝完整性促进癌细胞转移[9]，而另一项96例NPC石蜡包埋样本的回顾性分析发现，AFAP1-AS1在浸润淋巴细胞中高表达的患者更容易发生转移[10]。lncRNA H19也是NPC的促癌基因之一，能通过抑制miR-630 的活性而不是直接的相互作用来调节 EZH2 的表达，促进NPC细胞的侵袭转移[11]。也有新发现的lncRNAs在NPC中被探究，例如，LOC284454影响细胞骨架和黏附相关的Rho/Rac 信号通路，促进NPC的迁移和侵袭[12]，lncRNA-n326322通过激活PI3K/AKT 和 ERK/MAPK通路促进NPC细胞的增殖和迁移[13]。除此之外，lncRNAs在NPC中也可直接与靶基因结合，通过靶基因影响其功能。NPCCAT1和LncRNA PXN-AS1-L可分别结合YY1和SAPCD2促进细胞增殖和迁移[14-15]。当然，也有部分lncRNAs在NPC中影响生物学功能的机制尚不明确。

本研究中，笔者通过严格控制入组标准，筛选出2例无转移的NPC患者，3例转移NPC患者，其中转移患者均为全身多发转移。并成功提取患者外周血中的总RNA，使用全转录组测序方法检测样本中的lncRNAs，结果显示，差异表达的lncRNAs有14条，表达差异较大的为lncRNA ENST00000610778，其对应的基因为AC245060.5，定位于22号染色体。在NPC转移患者的血清中含量低，在非转移NPC患者血清中含量高，与转移组比较，差异倍数为4 011.71。这些差异表达的lncRNAs对应的基因富集到不同区域，参与细胞信号通路的调节。通过生物信息学分析发现，基因中RPL3、RPL12均编码一种核糖体蛋白，分别定位于22号、9号染色体，真核细胞80S核糖体定位于胞质，由60S大亚基和40S小亚基组成，60S大亚基含有46个核糖体蛋白，40S小亚基含有33个核糖体蛋白。而RPL3、RPL12均为60S亚基的组成部分。参与GO注释生物学过程、分子生物学功能、细胞学组分以及KEGG通路。其中，参与的生物学过程最多，共有7个，包括翻译、核糖体大亚基组装、SRP依赖的膜靶向共翻译蛋白、该图为KEGG网站的核糖体通路具体组成，红框部分L3、L12分别为RPL3、RPL12的简称，代表RPL3、RPL12参与核糖体通路病毒转录、核转录mRNA分解代谢过程、翻译启动以及rRNA加工。分子生物学功能富集于核糖体结构成分，细胞学组分富集于胞质大核糖体亚基、黏着斑。值得注意的是，RPL3、RPL12在KEGG信号通路中主要参与核糖体通路，KEGG网站中对应编号为map03010，在中心法则中负责翻译过程，由此推测本研究中它们相应的lncRNA ENST00000465618、ENST00000497322/ ENST00000497825，也可能与蛋白质的合成有关，具有潜在研究价值。可针对这些具有潜在研究价值的lncRNAs，在分子水平、细胞水平揭示它们与NPC转移发生的相关性及具体作用机制，为NPC转移的诊断和治疗提供靶点。

图3 核糖体通路组成

尽管lncRNAs与NPC相关性研究逐渐深入，但真正应用到实际临床工作中还需更多投入。主要难点在于：① lncRNAs自身作用复杂，且存在相互串扰，还有可能存在其他潜在机制，本研究鉴定出的lncRNA ENST00000610778、lncRNA ENST00000465618、ENST00000497322/ENST00000497825前期研究很少，尚未有文献报道其具体功能及作用机制；② 一种lncRNA往往参与多种疾病的发生，NPC特异性的lncRNAs很少报道，转移特异性的lncRNAs更是少见，因此，需要更大的样本量去发现和鉴定相关的lncRNAs；③ 实验室研究转化以及与临床应用的整合面临挑战，需要多学科的交叉、整合与协作。后续本课题组将继续围绕上述lncRNAs对NPC生物学影响深入展开体外及体内研究，为lncRNAs在NPC的临床应用提供基础。

本研究补充了人体外周血样本中转移性NPC的表达谱，鉴定出与非转移性NPC患者差异表达的一系列lncRNAs，提示lncRNAs可能参与NPC的转移过程，利用lncRNAs与其相应基因的功能相关性，对它们参与的生物学过程以及信号通路进行预测，为lncRNAs在NPC转移过程中的生物学作用及潜在机制研究提供思路和方向。