鲁中地区男性尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒基因亚型检测的研究

戴永刚，魏家富，张艳丽，程世亮，李 萌，刘 昊，王 园，于 淼

尖锐湿疣（condyloma acuminate，CA）好发于生殖器及肛周部位，且容易复发，是目前常见的性传播疾病之一，发病率呈逐年递增趋势[1]。人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是由约8 000 个碱基对双链环状DNA 和蛋白质衣壳组成的无包膜的病毒，属乳多空病毒科多瘤病毒亚科[2]。HPV 具有强嗜上皮性，感染后可导致人类皮肤和黏膜多种良性和恶性病变，男性感染HPV 后主要引起外生殖器和肛周疣[3,4]。目前已确定的HPV 亚型大约有200 多种，不同亚型的HPV 致病性存在很大差别。低危型 HPV 感染主要引起皮肤黏膜的良性增生，长期病毒感染尤其是高危型HPV 病毒的持续性感染与宫颈癌和生殖器肿瘤的发病密切相关。高危型HPV 感染还可引起男性肛门癌、阴茎癌以及口腔癌[5,6]。

HPV 病毒基因型具有显著区域差异，不同地区的主要致病基因型存在差异性，不同地区男性HPV亚型的感染率及各基因型的分布情况不尽相同[7]。鲁中地区是山东省经济较发达的区域，对研究经济发达地区男性HPV 感染的特征具有代表性，因此，独立研究此地区的男性HPV 基因亚型及分布特征对预防和治疗HPV 感染具有重要意义。笔者运用聚合酶链反应-反向斑点杂交技术（PCR-RDB）对男性尖锐湿疣患者皮损组织进行HPV 检测，并对521 例HPV检测阳性者的基因分型的分布情况进行分析，从而对其分子流行病学进行调查及研究。

1 材料与方法

1.1 标本来源

2014 年1 月—2019 年12 月，笔者采集了鲁中地区（包含济南、莱芜、东营、淄博、泰安）各市医院性病门诊男性尖锐湿疣患者标本，分别取自男性患者尖锐湿疣皮损部位的组织，包括尿道口、冠状沟、肛周、包皮等处。采集的标本立即放入专用样本采集管（深圳亚能生物技术有限公司提供的HPV23 分型细胞保存管）中，冷藏保存，并送往山东省立第三医院检验科进行HPV 检测。HPV 检测为阳性者进行统计学分析

1.2 仪器与试剂

Veriti™ Dx 热循环仪（ABI，美国）、核酸杂交仪（深圳亚能生物技术有限公司）、HPV DNA 基因分型检测试剂盒（深圳亚能生物技术有限公司）、恒温金属干浴器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

1.3 检测方法

1.3.1 标本采集与核酸提取 用试剂盒附带的取样拭子稍用力刮取患处皮损组织，放入专用的样品保存管中，按试剂说明书进行DNA 提取，在体系中加入提取好的DNA 模板5 μl 进行PCR 扩增，反应总体系25 μl 。

1.3.2 PCR 扩增反应条件 50 ℃ 15 min；95 ℃10 min；94℃ 10 s，42℃ 90 s，72℃ 30 s，共10 个循环；94℃ 10 s，46℃ 60 s，72℃ 20 s，共30 个循环；72℃ 5 min。扩增结束后95℃ 2 min 变性。

1.3.3 HPV 杂交 变性产物通过冰盒转移到核酸杂交仪上进行杂交、孵育和显色。按实际说明书和本实验室制定的SOP 文件进行杂交显色及判读结果，每组实验均设阴性和阳性对照，阴性和阳性对照均由试剂厂家提供。HPV 基因分型检测试剂盒（深圳亚能生物技术有限公司）能同时检测23 种基因型，包括低危亚型（HPV6、11、42、43、81 和83）和高危亚 型（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73 和82）。

1.4 统计学方法

采用SPSS22.0 统计软件进行统计学分析，计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV 基因型检测

本研究入选HPV 阳性患者共521 例，统计结果显示来自济南地区的患者比例最高，占比41.46%（216/521）。所有检测的23 种基因型中，检测出23 种，不同病毒亚型总计出现1 055 次阳性（含多种感染），其中低危型中HPV6 和HPV11 占比最高，分别为20.47%（216/1 055）和17.44%（184/1 055）。6 种低危型合计出现544 次，占比51.56%（544/1 055）；17种高危型合计出现511 次，占比48.44%（511/1 055），其中HPV52 和HPV16 在高危型感染中占比最高，分别为6.35%（67/1 055）和6.35%（67/1 055），见表1、表2。

表1 尖锐湿疣患者标本来源例数及比例

表2 521例男性尖锐湿疣患者皮损组织HPV基因分型分布情况

2.2 HPV 感染分布情况

521 例阳性样本中单一型感染244 例，单一感染率为46.83%（244/521）；多种感染277 例，多种感染率为53.16%（277/521）。HPV 多种感染百分率分布曲线呈现指数分布趋势，见表3，图1。

表3 HPV多种感染分布

图1 HPV多种感染百分率分布曲线图

2.3 HPV 不同感染类型构成情况

结果显示，检出单一型HPV 感染244 例，占比46.83%（244/521），在发生多种感染患者中，以高、低危 HPV 混合感染比率最高，占比42.03%（219/521），见表4。

表4 HPV不同感染类型构成比

2.4 尖锐湿疣患者HPV 感染年龄分布特征

HPV 阳性患者中年龄17 ～75 岁， 21 ～30 岁年龄段占比最高38.96%（203/521）；61 ～70 岁患者8 例，占比1.54%（8/521），70 岁以上患者占比最低0.38%（2/521），见表5。

表5 不同年龄段患者HPV感染构成比

3 讨论

HPV 感染与女性宫颈癌的发生发展的研究是多年来的研究热点，而对于男性尖锐湿疣患者HPV 感染的研究相对较少，缺乏相关的流行病学资料。近年来，尖锐湿疣由于亚临床感染的增加和频繁的复发率而引起了广泛的关注。男性HPV 感染率逐年增加，除引起尖锐湿疣外，还是导致外生殖器癌的重要因素。一些研究显示，HPV 亚临床感染在不同人群和地域的分布非常复杂[7]。为探讨鲁中地区男性HPV感染的分布情况，笔者采用PCR-RDB，对男性尖锐湿疣患者皮损组织进行了HPV 亚型检测和分析。

本研究发现鲁中地区男性尖锐湿疣患者HPV 感染亚型存在地域差异性。笔者研究的521 例HPV 阳性患者中共检测出23 种HPV 亚型感染，其中最常见的HPV 亚型依次为6、11、52、16、43。Chan 等[8]在中国香港的研究结果显示，最常见的HPV 亚型依次为6、11、16、52 和84；赵平安等[9]发现宁夏地区尖锐湿疣患者中最常见的HPV 亚型分别是HPV6、11、l6 、42、18，这提示HPV 感染亚型感染是存在地域差异性的，但一个共性是HPV6/11 是感染的优势亚型,这对本地区男性HPV 感染的防治提供了数据支持。

HPV6/11 是鲁中地区男性尖锐湿疣患者HPV感染的优势亚型。本研究纳入的521 例HPV 阳性感染者中，单一型HPV 感染244 例，占比46.83%（244/521），其中低危亚型以HPV6（20.47%）和HPV11（17.44%）最常见，而且比例明显高于其他亚型；高危亚型以HPV52 和HPV16 最常见（6.35%,67/521）。统计发现75.62%（394/521）的患者至少有HPV6/11 其中一项感染，这也为未来针对男性接种HPV 疫苗提供了数据支持，仅HPV6/11 疫苗就有可能使男性尖锐湿疣的发病率下降75%以上。

HPV 多种亚型感染即多种感染所占比例最高。本研究的数据显示，两种及以上混合感染占53.16%，最多可达到8 种类型同时感染。其中2 种（28.41%）和3 种（13.24%）比例最高。统计显示1 ～8 种HPV 亚型感染的检出率成指数曲线趋势，y= 1.213e-0.75x，R² = 0.973，这提示男性HPV 感染是机会性感染，种数越多感染机会越低，这个结果的发现是非常有研究价值的。

HPV 不同感染类型构成比结果显示混合型感染即高危组和低危组兼有的感染构成比例最高（219/521，42.03%）。多种低危型（6.53%，34/521）和多种高危型（4.61%，24/521）感染比例较低。结果表明鲁中地区男性尖锐湿疣患者HPV 感染多为高、低危亚型混合感染，这提示在检测男性尖锐湿疣患者HPV 感染时应当同时检测高危组和低危组亚型，尤其是HPV6、11、52 和16，单独低危组或高危组亚型的检测易导致漏诊。

通过对患者年龄分布特征的分析发现，21 ～30岁年龄组男性患者的HPV 感染率最高。可能的原因是此年龄段男性为性活跃人群，接触性伴多，有过非婚性接触史等导致这些人群感染率偏高。Schiffman等[10]认为大多数情况下生殖器部位感染 HPV 病毒是具有自限性的，机体能自行清除病毒而不会发生相关病变。HPV 的潜伏感染或亚临床感染，或是患者免疫功能低下无法自行清除病毒而导致的持续性感染则会引起生殖器疣或是生殖器癌症等疾病。因此对尖锐湿疣患者HPV 分型的检测及早期干预对患者的预后意义重大。综上所述，鲁中地区男性尖锐湿疣患者HPV 感染主要以HPV6、11 、16 和52 型为主，多发于21 ～30 岁男性，多种HPV 混合感染较单一型感染比例高，其中以高、低危型混合感染常见。

本研究结果有助于掌握鲁中地区男性HPV 感染的分子流行病学特征，为未来防治男性HPV 感染提供依据。