核酸扩增技术在毛孢子菌检测和鉴定中的应用进展

2020-12-23 23:44张德全敖俊红夏志宽杨蓉娅
实用皮肤病学杂志 2020年5期
关键词:探针孢子菌种

张德全,敖俊红,祝 贺,夏志宽,廖 勇,杨蓉娅

毛孢子菌可引起多种疾病,对免疫功能正常人群而言,可出现白毛结节病和超敏性肺炎,而在恶性血液病患者中常引起真菌血症、心内膜炎、腹膜炎和脑膜炎[1-5]。侵袭性毛孢子菌病常见于恶性血液病、烧伤、艾滋病(AIDS)、接受糖皮质激素或免疫抑制剂治疗的患者,以及接受心脏瓣膜或眼科手术者,还可发生于新生儿或衰弱性疾病患者中[1,2,6,7]。毛孢子菌感染缺乏特征性临床表现,仅依靠临床症状很难进行诊断。同时,毛孢子菌对棘白菌素类药物天然耐药,而临床中棘白菌素类药物常作为对具有患侵袭性真菌病风险患者的预防性用药,因此应更加警惕毛孢子菌感染的漏诊问题。

播散性毛孢子菌病的病死率高达50%~80%,在恶性血液病并出现持续性中性粒细胞减少患者中,病死率甚至可达100%[2,8,9]。阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T. asahii)是毛孢子菌感染最常见的致病菌[10],在临床诊断中对毛孢子菌感染的诊断及对T. asahii的快速识别显得尤为重要。传统的基于形态学特征和生化特性的检测方法,一方面需要较长的培养时间,培养要求较高,检测人员需要专业化培训;另一方面则容易出现属间混淆,且常无法鉴定至种水平[11-13]。因此,近年来为克服传统鉴定方法的不足,很多学者将不同核酸扩增技术(nucleic acid amplification technology,NAAT)应用于毛孢子菌的检测和鉴定中。聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是应用最为广泛的扩增技术,随着分子生物学的不断发展,NAAT 的种类也逐步增多。目前已应用到毛孢子菌检测和鉴定的NAAT有:普通PCR、巢氏及半巢氏PCR(nested PCR)、多重PCR(multiplex PCR)、实时荧光PCR、RCA、LAMP 以及上述技术与其他生化检测方法的联合应用等。本文将针对已应用于毛孢子菌研究中的变温NAAT 和恒温NAAT 两大类,从应用价值和目前存在问题的两个方面进行综述。

1 毛孢子菌鉴定的核糖体基因区选择

核糖体基因在细胞中以多拷贝形式存在,同时具有高突变性,在自然条件下可以出现多种变异,同时在高突变区间又存在相对保守区域,即异种同源性。可以针对这些突变区和保守区设计不同扩增目的的引物进行靶基因扩增,以达到对病原菌属间、种间甚至株间进行检测和鉴定的目的。较常应用于真菌分类鉴定的核糖体基因有基因内间隔区(intergenic spacer,IGS)、内转录 间隔区(internal transcribed spacer,ITS)、18S rDNA 和26S rDNA 的D1、D2 区。其中ITS 区因属内种间差异较大而种内差异微小,已成为真菌分类鉴定最常用的选择。

然而对于T. asahii、T. japonicum、T. asteroides、T. mucoides和T. dermatis而言,ITS 和D1/D2 区的基因序列高度相似,基因序列中仅表现为极少的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs),序列长度并没有差异[14,15]。徐英春团队报道基于ITS区对毛孢子菌进行鉴定时,T. mucoides和T. dermatis不能被区分开[16]。Sugita 等[17]在2002 年也发现ITS区 不 能 将T. asahii、T. asteroides、T. japonicum、T.coremiiforme和T. faecale等近源菌种进行区分。因此,ITS 区不适用于进行毛孢子菌属的种间鉴定。相反,IGS1 区由于具有更高的序列差异,更适用于对系统发生关系较近的毛孢子菌菌种进行区分[14,15,17,18]。

Sugita 等[17]根据IGS1 区的序列多态性描述了T. asahii的基因型,将来自于日本、美国和巴西的43 株T. asahii分为5 个基因型。至今,通过IGS1区序列多态性分析共发现了T. asahii的15 个基因型。Sellami 等[19]应用常规PCR 技术基于通用引物扩增IGS1 区对来自于突尼斯的30 株毛孢子菌进行了鉴定,并首次报道了该地区T. asahii的基因分型。Taverna 等[20]分别扩增了41 株毛孢子菌的D1/D2区、ITS 区和IGS1 区,并与Genebank 中的标准株序列进行比对,通过IGS1 区序列分析,将其中的38 株菌分别鉴定为T. asahii(n=29)、T. inkin(n=3)、T. montevideense(n=3)、T. faecale(n=2) 和T.dermatis(n=1),但这38 株菌的全部D1/D2 区和部分ITS 区序列分析比对结果由于种间的相似度差异极其接近,无法进行种水平的区分。在一项印度的研究中,将31 株临床来源的毛孢子菌的ITS 和IGS1区进行测序分析后,发现有30 株可以通过IGS1 区被准确鉴定到种水平[21]。鉴于上述文献报道,在今后应用NAAT 对毛孢子菌进行鉴定的研究中,应选择IGS1 区作为靶基因,以提高种水平鉴定的准确度。

2 变温扩增技术

2.1 常规PCR

PCR 技术由Mullis 在1985 年发明,是一种对特异DNA 片段进行体外扩增的技术,可以使少量的DNA 或RNA 进行大量复制,是遗传与分子生物学分析的基石,目前已在生命科学领域得到广泛应用。Sugita 等[22]早在1998 年将毛孢子菌属特异性引物应用于常规PCR 扩增毛孢子菌,共对20 个菌种进行了扩增,最早实现了应用NAAT 对毛孢子菌属水平的初步鉴定。近期Premamalini 等[23]通过Sugita 报道的毛孢子菌属特异性引物对临床来源的72 株毛孢子菌菌株进行常规PCR 扩增,在确定所有菌株均为毛孢子菌后,再进一步通过生理生化特性和表型特征进行种水平的鉴定。由于上述两项研究中的毛孢子菌属特异性引物基于18S rDNA 进行设计,因此无法进一步基于IGS1 区进行毛孢子菌的基因分型和菌种鉴定研究。

早在1998 年,Sugita 等[24]就报道了应用PCR对T. asahii进行鉴定的研究,该研究基于ITS 区设计T. asahii种特异性引物,78 株毛孢子菌中的14 株T. asahii全部呈阳性结果。但实际上该文献作为阳性结果报道的T. asahii var. coremiformisCBS2482 和T.asahii var. faecalisCBS4828 目前已被分别确定为T.coremiformis和T. faecalis,这可能是由于在进行引物设计时即按照旧的菌种分类作序列比对,因此不建议将该报道中的引物应用于今后的菌种鉴定研究中。以往应用于临床感染样本中毛孢子菌检测的常规PCR技术多依赖于扩增产物的测序。Kotwal 等[25]提取了来源于同一个家庭中3 名女性的病甲组织阳性培养物的DNA,应用ITS1 和ITS4 作为引物对所提取DNA样本进行PCR 扩增,最后通过ITS 区产物的测序明确感染菌种为T. asahii、T. asteroides和T. faecale,但笔者推测,该研究中的3 个毛孢子菌种可能是1 个菌种,需要应用IGS1 区进行重新比对方可最终确定菌种。Hazirolan 等[26]对从住院患者尿液分离出的68株T. asahii进行了IGS1 区PCR 扩增,发现该68 株菌分别属于基因型1、3、4、5、6、9。Sellami 等[19]同样通过应用PCR 扩增IGS1 区,对来自于突尼斯的30 株毛孢子菌进行了鉴定,并首次报道了该地区T.asahii的基因分型。

2.2 巢氏PCR

巢氏PCR 是在首轮PCR 过程中应用1 对外引物进行扩增,而后以首轮的产物作为模板再应用内引物进行第2 轮扩增,可明显提高PCR 检测的敏感性,适用于对微量靶序列的扩增,如各类临床组织样本中的病原体检测。Alonso 等[27]对10 例多发性硬化患者的脑组织切片和冰冻组织利用巢氏PCR 扩增ITS 区,通过对扩增产物进行测序,在8 例患者的临床样本中检测到T. mucoides。Zhang 等[28]通过巢氏PCR 检测380 名日本健康人皮肤中T. asahii的定植情况,先应用IGS 区通用引物26SF 和5SR 进行首轮扩增,而后应用种特异性引物进行第2 轮扩增,结果提示T. asahii的高定植率,最终得出T. asahii是人类皮肤正常微生物群落组成部分的结论。Sano 等[29]通过对30 份尸检组织标本进行3 组不同的巢氏PCR 扩增,分别验证了基于18S、26S 和ITS 区扩增的检测性能,结果提示基于ITS 区的扩增全部为阴性结果,而基于26S 区扩增的检出率高于基于18S 区。然而,Sano 等的研究中所应用的基于ITS 区的巢氏PCR 扩增,是以Sugita 在2001 年报道的巢氏PCR 技术对深部毛孢子菌感染患者血清进行检测的研究为参考,所应用引物和扩增条件均相同,但Sano 等所获得结果与Sugita 等[30]报道检测阳性率为(9/11)的结果截然不同。两项研究惟一不同之处在于前者是对经甲醛固定并行石蜡包埋的组织进行检测,而后者是针对感染患者血清进行检测。赵逊等[31]应用Sugita 报道的巢氏PCR 引物对来源于播散性毛孢子菌病患者的皮肤活检组织和肝脏穿刺标本蜡块组织,以及33个BALB/c 小鼠播散性毛孢子菌感染模型的肝脏石蜡标本进行检测,首次PCR 阳性率为69.7%,第2 次PCR 阳性率为96.9%。

巢氏PCR 可以不受平台期对扩增效率的限制,其对模板的放大倍数亦高于单次扩增,因此检测敏感性得到大幅度提高。而且由于第2 轮的引物与第1轮不同,降低了非特异性扩增的几率,在一定程度上提高了反应的特异性。此外,第二阶段的反应常常是第一阶段反应的验证过程,如果第一阶段反应的产物不是目的扩增产物,第二阶段反应便不再进行扩增,保证了整个反应的正确性和精准度。

2.3 多重PCR

多重PCR 技术应用2 对以上引物,对多个靶基因同时进行扩增,从而达到多重检测的目的。早在2001 年,Fujita 等[32]就试图通过多重PCR 技术对毛孢子菌进行鉴定,他们应用2 对通用引物ITS1、ITS4 和ITS3、ITS4,对T. asahii、T. asteroides和T.cutaneum进行扩增,并试图利用不同菌种间两种产物的长度差异,在琼脂糖凝胶电泳中对不同菌种进行区分,但研究结果显示T. asahii和T. asteroides的两种扩增产物长度极其相近,无法对上述两个菌种进行区分。随后Spiess 等[33]在2007 年应用多重PCR 技术对14 种致病真菌同时进行扩增,通过DNA 微阵列中的特异性核酸探针对菌种进行鉴定,其微阵列芯片中含有T. asahii特异性探针,在对来源于46 例中性粒细胞减少症患者的91 份临床样本进行检测后,成功从其中1 例患者的血液样本和肺泡灌洗液样本中检测到T.asahii。最近,Arastehfar 等[34]通过多重PCR 技术,应用基于18S rDNA 设计的种特异性引物分别对来源于CBS 的10 株T.asahii和7 株T.lactis进行了检测,并通过临床来源菌株进行了确证实验。该研究真正在扩增过程中实现了毛孢子菌的快速检测和鉴定,无需在扩增完成后进行任何后续操作,但由于以18S rDNA 设计种特异性引物,其鉴定的准确性尚需更大样本量更多菌种的实验进行评价。

2.4 实时荧光PCR

通过生成标准曲线和计算Ct 值,实时荧光定量PCR 可对起始模板量进行定性和绝对、相对定量分析。Makino 等[35]在研究日常食品酵母污染时,应用SYBR green I 作为荧光染料进行实行荧光PCR,根据26S 的D1 和D2 区设计T. asahii和T. jirovecii的共用引物,在进行特异性验证中,上述两株目的菌株可成功扩增,检测敏感性为102CFU/ml。近期,Sting 等[36]通过实时荧光PCR 联合Sanger 法测序对细菌和真菌进行了检测和鉴定,扩增过程中用SYBR green I 作为荧光染料,通过对D1、D2 区和ITS 区的分别和联合序列比对,将研究中两株菌鉴定为T.asahii。

TaqMan 探针法具有高度特异性,利用Taq 酶的外切核酸酶活性,探针被切断后产生荧光信号。2007年,Mekha 等[37]基于IGS1 区设计并应用T.asahii特异性引物和TaqMan 探针,可以将T.asahii与T.asteroids、T.coremiiformis、T. faecale、T. mucoides4 个菌种区分开,且实现了对临床样本中T.asahii的定量分析。分子信标是一种新型的荧光探针,结合靶序列后分子信标的环状变为链状,此时荧光分子与猝灭分子距离增大,所产生荧光可以被检测到,具有高灵敏度、高特异性等特点。Kumar 等[38]通过在实时荧光PCR 中应用4 种分子信标,对多个种属真菌不同分子信标Tm 值进行观察分析,得出了两种分子信标对于T.asahii的特征性Tm 值,并通过该特征性Tm 值在临床样本中成功检测出T.asahii。但该研究未进行T.asahii和毛孢子菌属中其他种的Tm 值比较,故尚不能完全确定该法对T. asahii检测和鉴定的准确程度。

2.5 基于PCR技术的其他方法

限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)是以PCR 和DNA 序列分析为基础,通过选择适当的限制性内切酶对PCR产物的特定位点进行酶切,在电泳中可得到特异性的电泳谱带,从而对基因分型进行鉴定。针对毛孢子菌进行PCR-RFLP 的研究较为有限,且多涉及动物和食品加工领域。Sadrossadati 等[39]在对念珠菌血症患者进行ITS 区基因多态性分析后,204 份阳性血培养样本中共鉴定出3 份样本为T. asahii。Attchelouwa等[40]通过对发酵食品中的菌株进行PCR-RFLP 分析,应用Hae III, Hinf I 和 Cfo I 对ITS 区和D1/D2区的多态性进行分析,成功检测到T. asahii和T.coremiiforme。到目前为止,在PubMed 官网可检索到的关于涉及毛孢子菌限制性片段长度多态性分析的文献中,均为针对ITS 区的相关分析,且无应用IGS1 区序列进行种水平鉴定的比对,因此无法确定上述文献报道的关于毛孢子菌鉴定结果是否准确。

随着基因工程研究的不断深入,核酸分子杂交技术的方法不断被应用于毛孢子菌的检测和鉴定中。Southern 印迹杂交技术可通过将待测核酸分子与核酸同位素标记探针的杂交实现检测目的,Nagai 等[41]针对毛孢子菌26S 区设计特异性内外引物,应用巢氏PCR 对临床样本中的毛孢子菌种进行了成功检测,并结合Sourthern 印迹杂交技术将临床常见的两种致病菌种T. asahii和T. mucoides进行区分,通过11 份经组织学诊断为播散性毛孢子菌病的血清样本验证,敏感性为64%。狭缝印迹杂交是从Southern 印迹杂交技术的基础上发展而来,Loeffler 等[42]应用狭缝印迹杂交法(slot blot hybridization)对酵母菌进行检测,应用基于ITS 区设计的T. cutaneum种特异性探针成功检测到该菌。

DNA 微阵列芯片法基于反向杂交技术,固定在芯片的探针与待检测核酸片段杂交可产生荧光信号,通过对荧光信号的检测间接对扩增产物进行判断。Spiess 等[33]通过应用DNA 微阵列芯片法检测PCR扩增产物,对多种致病真菌及临床样本进行检测,该研究基于ITS区设计了T. asahii的特异性引物和探针。Hsiue 等[43]通过设计针对5 种毛孢子菌种的ITS 区探针,从116 例血培养呈真菌阳性的血液样本中成功检测出2 例样本中的T. asahii。该法较为适用于高通量检测,而面对临床样本量较少的检测需求时,成本往往较高。Luminex 液相芯片技术通过标记在微球上标记荧光染料,同时微球可以结合特异性探针,通过红色激光激发荧光以鉴定微球种类,再通过绿色激光激发报告分子,从而实现定量分析。Diaz 等[44]应用Luminex 100 技术和基于D1D2、ITS、IGS 区设计的48 条特异性探针对34 个毛孢子菌种进行检测,种间的有效区分精细度达1 bp,可在50 min 内完成高通量检测。

3 等温扩增技术

3.1 环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)

该技术于2000 年问世,需应用4 对特异性引物,在链置换DNA 聚合酶的作用下于恒温条件下完成扩增[45]。该技术可在60 ~65℃的恒温下,经过30 ~60 min 扩增获得指数级核酸分子拷贝增量。LAMP 技术不需要常规PCR 的热循环和温度升降,操作过程简便、快速,通过加入荧光染料还可以实现对反应过程的实时监测,也可以通过肉眼观察荧光为扩增结果定性。2014 年,Kasahara 等[46]报道应用LAMP 技术对机会性病原酵母菌进行检测,研究中针对T. asahii和T. mucoides设计了IGS1 区的种特异性引物,并用除上述两菌种外的12 个毛孢子菌近源菌种检测特异性,结果显示只检测到目标菌种,T. asahii和T. mucoides纯培养的检测灵敏度分别为1.3CFU/ml 和1.6×102CFU/ml。上述研究中仅将3 株T. asahii和1 株T. mucoides作为实验菌株,其检测特异性尚需更大样本量的研究验证。Zhou 等[47]将15 株T. asahii和14 株近源菌株作为LAMP 检测菌株,基于IGS1 设计T. asahii种特异性引物,通过感染小鼠模型和临床样本完成特异性验证,成功建立了可以直接应用于临床样本的T. asahii的LAMP 快速检测方法,该研究还实现了以荧光染料为基础的可视化结果判读。

3.2 滚环扩增技术(rolling circle amplification,RCA)

RCA 技术是一种新型的等温扩增技术,利用DNA 或RNA 聚合酶使引物沿闭合环状模板进行扩增,从而得到长单链DNA 或RNA,包括锁式探针扩增、线性扩增、指数扩增和多引物滚环扩增[48]。在整个反应过程中,最关键的步骤是目的核酸链特异性成环,这是扩增开始的必要条件,同时可以应用具有荧光标记的寡核苷酸探针完成特异性实时检测。RCA技术对单核苷酸多态性的检测敏感性较高,适用于对种水平特别是种系发生关系较近的菌种进行区分[49,50]。Xiao 等[51]分别应用RCA 技术和基于PCR 的反向线性点(reverse line blot,RLB)杂交技术对T.asahii、T. cutaneum、T. dermatis、T. domesticum、T.inkin、T. japonicum、T. jirovecii和T. laibachii8 个毛孢子菌种的48 株菌株进行检测,该研究基于ITS 区和D1、D2 区设计种特异性探针,结果显示RCA 可以将所有研究菌株准确鉴定至种水平,而RLB 技术不能直接将T. dermatis和T. japonicum鉴定至种水平,需要通过与近源菌株(T. dermatis和T. jirovecii、T.asahii和T. japonicum)探针相结合检测进行排除后确定菌种,该研究显示出RCA 技术在近源菌株种间鉴定研究中的优势。RCA 技术检测的整体过程需要数小时的反应时间,第一步的成环过程需根据不同连接酶设置不同的高温条件,扩增温度根据不同的扩增类型而不同,较常用的扩增温度为30℃。与LAMP技术相比,虽然RCA 技术在反应条件和时间上没有前者更为简化,但其不需要过多的引物引发,产物较为单一,同样具有广阔的应用前景。

4 总结与展望

上述各种NAAT 的出现和应用,可使毛孢子菌感染的诊断较以往的形态学鉴定和生化特性检测方法更加有针对性,给毛孢子菌感染的诊断和菌种鉴定提供了宽广的发展空间。以PCR 为代表的变温扩增技术仍是目前毛孢子菌鉴定工作的主流技术,不同类型PCR 技术的应用选择往往取决于研究目的和待测菌量差异,如针对临床组织样本中微量毛孢子菌的检测常选用巢氏PCR 技术,针对毛孢子菌的多菌种鉴定或多靶基因扩增常选用多重PCR 技术,上述两种技术与常规PCR 技术都可以实现毛孢子菌的定性检测。对于需要对毛孢子菌进行定量分析研究时,则可选用实时荧光PCR。而对于高通量的毛孢子菌检测或鉴定工作,可选用PCR 与核酸分子杂交技术相结合的方法,特别是DNA 微阵列芯片法在今后高通量致病菌检测中的表现更值得期待。与变温扩增技术相比而言,等温扩增技术在一定程度上摆脱了特定变温设备的限制,具有在常规恒温设备或环境中的应用潜力,其便捷、快速、不依赖特殊设备等优势较适用于目前毛孢子菌感染零散发病的临检需求。

同时,目前NAAT 在毛孢子菌研究中的应用仍存在可改进和优化的空间,如样本准备和处理流程较为复杂且耗时较长,令NAAT 不能发挥出时效性优势;基于IGS1 区进行特异性扩增的研究数量仍为少数,使得既往很多研究中毛孢子菌菌种鉴定结果的可信度下降;目前绝大多数NAAT 技术对特定设备的依赖性依然较高,限制了基于NAAT 的检测方法的推广应用。因此,应着眼于缩短检测的总体耗时,特别是在简化样本准备和处理流程、降低NAAT 对特定设备的依赖性、简化结果判读方法等三个方面进行深入研究,开发新的方法或优化已有方法,以实现基于NAAT 的毛孢子菌感染的快速诊断。

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