恶性黑素瘤细胞miR-508-3p与叉头框转录因子C1的关系及对增殖、迁移和侵袭的影响

朱世文，王 刚，罗文娟，王丽雯，王 倩

恶性黑素瘤（malignant melanoma，MM）是一种源自黑素细胞的恶性肿瘤，患病人数全球每年大约有30 万人[1]。虽然近年来MM 的治疗方法进展迅速，但是癌症患者的病死率仍然较高。研究发现microRNA（miRNA）在MM 发生发展中发挥重要作用[2,3]。miR-508-3p 已经在多种癌症中作为抑癌基因被报道过，如肾癌、三阴性乳腺癌等[4,5]。但miR-508-3p 在MM 细胞中的表达及其作用报道甚少。本研究以MM 细胞系A375 为对象，探讨miR-508-3p与叉头框转录因子C1（Forkhead box C1，FOXC1）的关系及其在MM 中的表达和作用机制，为寻找MM 的分子治疗靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

HEM 正常黑素细胞及A375 MM 细胞（上海酶联生物科技有限公司）。胎牛血清、RPMI1640 培养基（美 国Gibco 公 司）。LipofectamineTM2000（美国Thermo Fisher 公司）。二甲基亚砜（DMSO）、3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT]、Trizol 试剂、一步法反转录荧光定量试剂盒（上海生工生物科技有限公司）。miR-508-3p、U6、FOXC1 和GAPDH 引物均由上海生工生物科技有限公司设计并合成。荧光素酶检测报告系统试剂盒（美国Promega 公司）。miR-508-3p mimics、miR-508-3p inhibitor 及各自阴性对照（上海吉玛制药技术有限公司）。Transwell 小室（美国Corning 公司），matrigel 胶（美国B＆D 公司）。蛋白双染marker、显影液、5%脱脂奶粉、小鼠抗FOXC1 单克隆抗体、小鼠抗GAPDH 单克隆抗体及山羊抗鼠IgG 二抗（上海生工生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）实验检测miR-508-3p 和FOXC1 mRNA 的表达 收集生长状态良好的对数生长期A375 细胞和正常黑素HEM 细胞，分别加入TRIzol 提取RNA，再参照一步法反转录荧光定量试剂盒检测miR-508-3p 的表 达。miR-508-3p 正向：5'-CCACCTTCAGCTGAG TGTAGTG-3'，反向：5'-CCACCAAATATGCGTTACG TGAT-3'；U6 正 向：5'-GCTTCG GCAGCA CA-3'， 反向：5'-AACGCTTCACGAATTTGC GT-3'。FOXC1 正向5'-CGGGAGATGTTCGAGTCACA-3'， 反向：5'-TGTTCGCTGGTGTGGTGAAT-3' ；GAPDH 正 向：5'-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3'，GAPDH 反 向：5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'。

1.2.2 细胞转染及分组 将生长状态良好的对数生长期A375细胞按照每孔2×105个接种至6孔细胞板上，置于37 ℃、5% CO2和饱和湿度的培养箱中常规培养过夜。制备终浓度为80 nmol/L miR-508-3p mimics或80 nmol/L miR-508-3p LipofectamineTM2000脂质体复合物，根据转染试剂LipofectamineTM2000说明书步骤进行转染，同时设置对应的对照组分别为mimcs NC组、inhibitor NC组。

1.2.3 MTT法检测各组细胞的增殖能力 收集各组转染48 h后的A375细胞，每孔2×104个接种于96孔细胞板上，培养48 h后，每孔中加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液，继续培养4 h，弃培养液，加入150 μl DMSO振荡15 min，用酶标仪于490 nm检测各孔的A值，每组实验重复3次。细胞增殖率(%)=(A实验组－A本底组)÷(A对照组－A本底组)×100%。

1.2.4 Transwell实验各组迁移和侵袭的能力 收集各组转染48 h后的A375细胞，每孔2×104个接种于matrigel胶包被/未包被的Transwell小室中，下室中加入600 μl含血清的培养液，培养48 h后，质量分数为4%多聚甲醛固定30 min，质量分数0.1%结晶紫溶液染色，用棉签擦掉小室的上层细胞，显微镜观察并拍照。

1.2.5 RT-qPCR实验各组miR-508-3p和FOXC1 mRNA的表达 收集各组转染48 h后的A375细胞，按照1.2步骤进行操作。

1.2.6 Western blot 实验各组FOXC1 蛋白的表达 收集各组转染48 h 后的A375 细胞，分别加入RIPA 裂解液并在冰上放置20 min，4℃ 13 000 r/min 离心20 min，采用BCA 试剂盒测定上清的蛋白含量。取35 μg 总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转PVDF 膜，用2%BSA 封闭液封闭，分别加入FOXC1 一抗4℃过夜，以GAPDH 抗体为参照，再加入二抗室温孵育1 h。ECL 曝光成像，采用Alpha Imager HP 凝胶成像系统分析结果。

1.2.7 荧光素酶报告基因检测FOXC1 和miR-508-3p结合 建野生型（FOXC1-W）和突变型（FOXC1-M）的FOXC1 3'-UTR 双荧光报告质粒。将对数生长期的A375 细胞以每孔105个接种至12 孔细胞板上，将FOXC1-W、FOXC1-M 与miR-508-3p mimics 或mimics NC 阴性对照共转染至A375 细胞。每组实验设置6 个重复。培养箱内培养48 h 后，参照双荧光素酶报告基因检测试剂盒步骤检测荧光素酶活性。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism5 统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量数据以均值±标准差（x¯±s）表示，多组之间的比较采用方差分析，两组间比较采用t检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-508-3p和FOXC1在HEM正常黑素细胞及A375 MM细胞中的表达

RT-qPCR 检测结果表明，A375 MM 细胞中miR-508-3p 的相对表达量为9.84±0.46，与HEM 正常黑素细胞26.30±0.43 比较，明显降低（t=48.67，P＜0.001）。A375 MM 细胞中FOXC1 的相对表达量为18.00±0.87，与HEM 正常黑素细胞11.30±0.31比较，明显升高（t=7.22，P＜0.001）（图1）。

2.2 过表达/降低miR-508-3p对MM A375细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

MTT 和Transwell 实验结果显示，与inhibitor NC组相比，转染miR-508-3p inhibitors 组的A375 细胞的增殖（t=9.552，P＜0.001）、侵袭（t=4.25，P=0.01）及迁移（t=7.31，P=0.002）能力明显增强；与mimics NC 组相比，转染miR-508-3p mimics 的A375 细胞的增殖（t=26.56，P＜0.001）、侵袭（t=7.29，P=0.002）及迁移（t=3.31，P=0.03）能力明显降低（图2）。

图1 miR-508-3p和FOXC1在HEM正常黑素细胞及A375 MM细胞中的表达

图2 过表达/降低miR-508-3p对MM A375细胞增殖、迁移及侵袭的影响

2.3 过表达/降低miR-508-3p对MM A375细胞中miR-508-3p和FOXC1表达的影响

RT-PCR 和Western blot 实验结果显示，与inhibitor NC 组相比，转染miR-508-3p inhibitor 组的A375 细胞中miR-508-3p 的表达明显下调（t=24.82，P＜0.001），FOXC1 mRNA（t=66.11，P＜0.001）和蛋白（t=10.73，P＜0.001）的表达明显升高；与mimics NC 组相比，转染miR-508-3p mimics 组的A375 细胞中miR-508-3p 的表达明显升高（t=43.49，P＜0.001），FOXC1 mRNA（t=101.1，P＜0.001）和蛋白（t=9.52，P=0.001）的表达明显降低（图3）。

2.4 FOXC1是miR-508-3p的靶基因

应用Starbase 生物信息学网站预测FOXC1 3'-UTR 上存在miR-508-3p 的结合位点（图4A）。荧光素酶实验结果显示：在FOXC1-W 组中，与NC mimics 组相比，miR-508-3p mimics 组荧光素酶的活力值明显降低（t=19.60，P＜0.001）。但在FOXC1-M 组中，荧光素酶的活性无明显变化（图4B），证明miR-508-3p 靶向结合FOXC1 的3'-UTR。

图3 过表达/降低miR-508-3p对MM A375细胞中miR-508-3p和FOXC1表达的影响

图4 miR-508-3p与FOXC1的靶向关系

3 讨论

国内黑素瘤新发病例每年约有2 万例，特点为快速发生，易发生远处转移，预后差，严重影响人民健康[6]。目前对于黑素瘤诊断包括全身检查、组织病理学检查、影像学及实验室检查等，但仍无特异性的生物学标志，因此在MM 中对于生物学标志的选择以及潜在机制的研究显得尤为重要[7]。

miRNA 是一类非编码的含有20 ～25 个核苷酸内源性小RNA，可以结合在靶基因mRNA 3'端非翻译区(3'-UTR)，从而降解靶基因的mRNA，抑制蛋白的翻译。目前研究发现miRNA 在MM 的发生和发展过程中的作用不可忽视[8,9]。miR-508-3p 属于miR-506 家族，在多种肿瘤中异常表达，扮演抑癌基因角色[4,5,10]。在骨肉瘤组织中，miR-508-5p 表达降低且与Enneking 分期和碱性磷酸酶水平有关[10]。在肾癌中，miR-508-3p 在组织和患者血浆中显著下调，且在体外过表达miR-508-3p 可抑制786-0 细胞增殖，诱导细胞凋亡，抑制细胞迁移[4]。在三阴性乳腺癌研究发现，miR-508-3p 在三阴性乳腺癌组织和细胞株(BT-549 and MDA-MB-231)中的表达明显下降，且miR-508-3p 通过靶向作用锌指转录因子（zinc finger transcription factor，ZEB1），进而抑制上皮间质转化，从而可以抑制三阴性乳腺癌侵袭性[5]。本研究采用miR-508-3p mimics 转染的A375 细胞，其增殖、迁移、侵袭能力均降低，采用miR-508-3p inhibitors 转染的A375 细胞，其增殖、迁移、侵袭能力均升高。以上结果表明miR-508-3p 在MM 的发生发展过程中发挥抑癌作用。值得注意的是，Liu 等[11]研究表明，下调miR-508-3p 可以通过调节SRY（sex-determining region Y）-box6基因的表达促进黑素细胞中黑素生成，这说明在MM 患者中，miR-508-3p 的表达下降，不但可能促进癌症的发展，而且可能会促进黑素的生成。

FOXC1 是FOX 蛋白家族成员之一，也被命名为FKHL7 553 个氨基酸编码，相对分子质量57 000。目前越来越多的研究表明，FOXCl 在恶性肿瘤转移及耐药中亦扮演着重要的角色[12]。研究证实在肝癌[13]、MM[14]、胃癌[15]、肺癌[16]、乳腺癌[17]等癌组织中FOXC1 的表达明显高于癌旁组织，且高表达的FOXCl 可诱导上皮细胞-间充质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT），促进肿瘤细胞的转移及侵袭，减少肿瘤细胞对化疗药的敏感性。另外，Gao 等[18]研究表明在喉鳞状细胞癌降低FOXC1，细胞增殖、侵袭、转移等恶性行为受到抑制。本研究应用Starbase 生物信息学数据库预测FOXCl 存在miR-508-3p 的潜在的结合位点。本研究通过荧光素酶报告基因技术检测证实了miR-508-3p 和FOXCl 的靶向关系。结合上述内容，笔者推测miR-508-3p 可以通过靶向FOXCl 抑制A375 细胞增殖、侵袭及转移。

综上所述，miR-508-3p 在MM 中低表达，在MM 细胞增殖、侵袭及转移中发挥着抑癌作用，这种抑癌作用的机制可能与抑制FOXCl 的表达有关。本研究为miR-508-3p 有可能成为MM 分子诊断的靶点提供理论基础。