分子生物学在食品检验中的应用

□ 秦鹏钧 大连产品质量检验检测研究院有限公司

近年来，世界各地区食品安全恶性事件频繁发生。据报道，2020 年7月29 日，约旦首都安曼发生大规模食物中毒事件，导致至少700 人中毒，其中一名儿童死亡。此外，因食品安全问题，美国先后召回2 800 万箱谷物早餐制品、5.5 亿枚鸡蛋。食品安全问题给各个国家和人民带来了巨大的损失和痛苦。

传统培养方法检测微生物时，受到食品环境胁迫或受损的微生物细胞通常需要在特殊的培养条件才能恢复生长，导致其难以被分离。发展及时、准确检出食品中微生物的技术迫在眉睫，这一现象促进了以PCR 等为代表的分子生物学技术在食品微生物及相关领域研究中的应用和发展。分子生物学技术具有快捷、灵敏、准确等优点，可精确确定存在于食品中的微生物种类及菌群情况。

1 聚合酶链反应（PCR）及相关技术

聚合酶链式反应是由K. Mullis 建立的一种体外扩增特异DNA 片段的技术。它利用变性与复性原理，使用DNA 聚合酶，在引物和dNTP 的参与下，在数小时内在体外对特异DNA 片段进行百万倍扩增[1]。这种技术具有灵敏度高、特异性强、操作简便等特点。

1.1 多重PCR 技术

食品中通常含有不止一种致病菌，而普通PCR 技术仅可对单一致病菌进行定量定性分析，在此技术基础上衍生了多重PCR 技术，通过对引物、温度等条件的改变，可对两种或两种以上致病菌进行同时检测，是食源性致病菌检测的重要发展发向。Elizaquivel 等运用该技术对沙门菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行同时检测[2]。

1.2 RT-PCT

RT—PCT（反转录PCR），以mRNA为模板，通过反转录酶逆转录cDNA，然后将此为模板，使用特异性引物，扩增目的序列[3]。该法可在基因表达水平层面上检测细胞或者组织，还可以检测细胞中RNA 病毒的含量或直接扩增特定基因的cDNA 等。

1.3 实时定量荧光PCR 技术

该技术是将荧光分子加入反应体系中，然后通过检测荧光信号来实时反映DNA 量，可以实时观测到PCR产物。而多重实时荧光定量PCR 可实现大肠杆菌、沙门菌和金葡球菌的同时、高效共检。相关人员利用该方法，对40 份食品样品中的单增李斯特氏菌进行了检测，其灵敏度达只需19 个细菌就可以得到阳性结果[4]。

2 以16S rRNA 为靶基因进行的检测技术

16S rRNA存在于所有原核细胞中，有较高的拷贝数，其序列中含可变区及高度保守区，因此可设计群、属、种特异性探针进行微生物检测。对细菌中的16S rRNA 基因进行测序是当前细菌鉴定的“金标准”。冯金牛等人利用该方法对鸭疫里默氏杆菌DNA 进行检测的最小检出量为1.907×10—5g/L，菌液的最小检出量为1.5×104CFU/mL[5]。

3 DNA 指纹图谱技术

英国遗传学家Jefferys 等在1984年将人源小卫星DNA 用作基因探针，同人体核DNA 的酶切片段杂交，获得了长度不等的杂交带图纹，因为获得的图纹几乎都不相同，其个体识别能力足以与手指指纹相媲美。目前，随着科技的发展，已衍化出多种技术。

3.1 变性梯度凝胶电泳标记技术（DGGE 技术）

DGGE 技术是在变性剂的作用下从而使DNA 片段电泳迁移率发生变化，使片段大小相同碱基不同的DNA 片段分开。在食品中微生物的分离、鉴定中使用广泛，也可以确定生物群落的变化。Ampe 等利用该技术检测酸化木薯淀粉发酵过程中的生物群落，检测到链球菌、乳球菌等微生物[6]。

3.2 温度梯度凝胶电泳技术(TGGE技术)

TGGE 技术是在DGGE 基础上进一步发展的技术，与DGGE 不同的是，该技术在引物的5’端加入3 050 bp 的GC 片段且有温度梯度变化[7]。该技术的特点是可以发现目前尚未被认识的肠道细菌，但在食品检验中的应用较少。

3.3 随即扩增多态DNA 技术（RAPD技术）

RAPD 技术的特点是引物随机，扩增后会得到不同大小的DNA，通过分子标记，对不同大小的DNA 进行差异性分析。该技术以整个细菌DNA 基因组为对象，特异性和敏感性较高，在分子生物学研究甚少的领域或者分子生物学特征不明确或不了解基因组DNA 序列的真菌和乳酸菌的检测中都可以应用该技术。实际应用中在品种纯度检测方面应用较多。如余四斌等人利用该技术快速鉴定杂交水稻种子的纯度[8]。

3.4 核糖体RNA 基因分析技术

现存的所有生物基本都含有核糖体，且rRNA 序列在同种生物细胞中的差异很小，在不同的生物种群中可以通过对比碱基进行分析，相应的技术方法即是核糖体RNA 基因分析技术，在菌株的分离鉴定中有极大的优势。该技术可用于副溶血性弧菌、李斯特菌、沙门氏菌、霍乱弧菌等的检测[9]。

4 分子印迹技术

1975 年Southern 首先提出了分子印迹的概念。原理是将一个具有特定形状和大小的、可识别的分子作为模板分子，将其溶于交联剂中，再加入特定的功能单体聚合物后，形成高度交联的聚合物，其内部包埋有可与功能单体相互作用的模板分子，然后利用物理或化学方法将模板分子洗脱，这样聚合物母板上留下了与模板分子形状相似的孔穴，且孔穴内各功能基团的位置与所用的模板分子互补，可与模板分子发生特殊的结合作用，从而实现对模板分子的识别[10]。近年来，分子印迹技术运用十分广泛，无论是DNA、RNA 还是蛋白质层面的检测都可运用该技术。

4.1 Western blotting

Western blotting 即为蛋白质印迹法。它的原理是抗原抗体的特异性结合。将从待测样品中提取的分子大小不同的蛋白质（抗原）混合物用凝胶电泳法分离后，将其转移到固定支持物上，用带有标记的抗体做探针与之杂交，通过放射自显影等技术检测基因表达的产物。金明国等人就是利用通过Western blotting 技术准确检测马槟榔甜蛋白[11]。

4.2 Dot blotting

Dot blotting 即为斑点印迹技术。它是一种酶免疫分析技术。它的原理是用点滴法或电斑法将抗原转移到尼龙膜上或硝基纤维膜上。该法敏感度极高，毫/微克水平的特异性抗原也可以成功检出。斑点印迹技术对实验室及设备的要求低，是比较容易掌握的一门技术。杨靖亚等人利用斑点印迹法技术特异性检测致病性副溶血弧菌,灵敏度高、操作简单，可用肉眼判定结果[12]。