鱼腥草总黄酮化合物对人肝癌细胞BEL-7402生长的影响分析

徐静 朱国庆 周义浪 王敏 孙丽娥 蒋梅

（贵州中医药大学第二附属医院肿瘤科 贵州 贵阳 550003）

鱼腥草是一类在东南亚地区或国内南方地区大规模生长的三白草科蕺菜，其主要功效为：清热解毒、利尿通淋等。有研究者对鱼腥草的药理作用进行研究发现，鱼腥草除上述作用外，还有抗菌消炎、抗肿瘤、抗病毒等功效[1]。黄酮类化合物是一类多酚化合物，在多类植物中都广泛存在，能够阻碍细胞的增殖，对细胞凋亡产生诱导，同时还可对抑癌基因的活性产生加强作用，并对癌基因的表达产生抑制作用[2]。本研究在研究开始前，对鱼腥草总黄酮化合物的成分和含量进行检测和分析，并在此基础上围绕其对人肝癌细胞BEL-7402生长的阻抑作用进行研究，期望对鱼腥草的抗癌作用机理进行详细阐述，为鱼腥草在临床抗肿瘤的实际运用中提供参考。

1.资料与方法

1.1 药材

本研究于2016年8月在贵阳市百宜乡和遵义市的新浦区鱼腥草种植基地内选取本研究所用的新鲜鱼腥草的根和叶。送至贵阳中医学院药学院进行鉴定，确定本研究所采取的鱼腥草是三白草科蕺菜属植物蕺菜的新鲜全草。

1.2 试剂与细胞株

本研究使用的试剂有：二甲基亚砜（DMSO）（由江西洪瑞生物技术有限公司提供）、四甲基偶氮唑蓝干粉（同上）、碘化丙啶（同上）。AnnexinV-FITC/FITC双染试剂盒（同上）。芦丁是本研究自行配制的，其浓度＞98%。AB-8型大孔吸附树脂由天津南开大学化工厂提供。

人肝癌细胞BEL-7402由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。

1.3 黄酮提取物样品溶液的配制

对粗提取物进行称量，将适量的黄酮提取物放入无血清培养基中溶解，配制浓度为6.4g/L的母液，使用规格为0.22μm的滤膜进行过滤，然后将其封存放置于温度为4℃的环境中留存备用。

1.4 细胞培养

将人肝癌细胞BEL-7402放置在无菌DMEM细胞发育培养液中继续拧培养，并将其放置在环境温度为37℃，CO2体积分数为5%的细胞培养箱中进行培养。每隔3天左右的时间对细胞进行一次传代，选取生长期为对数的细胞作为本研究的样本细胞。

1.5 鱼腥草总黄酮提取物对人肝癌细胞BEL-7402体外增殖的作用研究

运用DMEM培养液，对人肝癌细胞BEL-7402进行稀释，配制成0.5×108L-1的细胞悬液，并在96孔板上进行接种，各孔均有100μL的培养液和5000个细胞，将其放置在环境温度为37℃，CO2体积分数为5%的细胞培养箱中进行培养。当细胞完全贴壁后，将浓度为0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L、1.6g/L、3.2g/L、6.4g/L的鱼腥草总黄酮化合物分别加入到培养板中，各个浓度水平的药物均设置了3个复孔，并设置不添加任何药物的细胞以及添加溶剂的细胞作为对照组，同时还设置调零孔，将其放置在环境温度为37℃，CO2体积分数为5%的细胞培养箱中进行培养，时间为48小时。

1.6 细胞凋亡的检测

运用AnnexinV/P I双染-流式检测方法，对细胞凋亡的水平进行检测。在6孔板中，将对数生长期的细胞接种于此，人肝癌细胞BEL-7402的浓度水平是2.5×108L-1，各孔的接种量为2ml，将其放置在环境温度为37℃，CO2体积分数为5%的细胞培养箱中进行培养。当细胞完全贴壁以后，吸取培养液后放弃，将药物浓度为0.5g/L、0.8g/L、2.0g/L的无血清DMEM培养液分别加入其中，并设置对照孔，继续进行培养，时间为48小时。

1.7 统计学方法

2.结果

2.1 鱼腥草总黄酮提取物对人肝癌细胞BEL-7402体外增殖的影响

MTT结果显示，鱼腥草总黄酮化合物的浓度为0.1g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.8g/L、1.6g/L、3.2g/L、6.4g/L时，会以浓度依赖性的形式，对人肝癌细胞BEL-7402的增殖产生阻抑作用，且鱼腥草总黄酮化合物的浓度越大，抑制水平越高。

2.2 鱼腥草总黄酮提取物对人肝癌细胞BEL-7402凋亡产生的影响

AnnexinV/P I双染-流式检测结果显示，鱼腥草总黄酮化合物发挥药效后，当浓度为0.5g/L、0.8g/L，且作用48小时后，细胞凋亡的数量在一定程度上升，当浓度达到2.0g/L时，细胞凋亡水平达到最大值，总细胞凋亡水平为89.7%。其中在添加药物的组中，早期凋亡的细胞水平在一定程度上有所增加。

3.讨论

临床医学认为，鱼腥草能够清肺化痰，同时还能够治疗白血病、抵抗癌细胞和氧化放映。本研究开展前，曾通过研究发现，在鱼腥草中，含有黄酮、生物碱等成分，且发现部分以鱼腥草为主要药材的药品，如先鱼汤、参慈胶囊等，可对肺癌细胞产生阻抑作用，效果十分理想。黄酮类化合物是一类多酚化合物，在多类植物中均可检测出该物质，其潜在的药用价值较高，目前临床研究者热衷于对其抗肿瘤的作用进行研究。本研究运用鱼腥草总黄酮化合物对人肝癌细胞BEL-7402生长的抑制作用进行研究，结果显示，在人肝癌细胞BEL-7402生长过程中，鱼腥草总黄酮提取物可发挥显著的阻抑作用，依据检验结果，设置不同浓度水平的药物组，运用流式细胞仪，对鱼腥草总黄酮化合物对人肝癌细胞BEL-7402生长的影响进行检验，结果显示，在人肝癌细胞BEL-7402的生长过程中，鱼腥草总黄酮化合物能够阻抑作用。

综上所述，在人肝癌细胞BEL-7402生长中，鱼腥草总黄酮提取物可诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖。