石菖蒲挥发油中主要成分α-和β-细辛醚的神经药理学作用及机制研究进展

徐飞飞，李钦青，楚世峰，贺文彬*

1山西中医药大学 中医脑病学山西省重点实验室，太原 030624；2中国医学科学院药物研究所，北京 100050

传统中药石菖蒲(A.tatarrinowiiSchott)始载于《神农本草经》，来源于多年生草本植物石菖蒲的干燥根茎，其气味芳香，性辛，味苦，温，归胃、心经，作为一种开窍药被广泛熟知[1]。石菖蒲具有化湿开胃、豁痰镇咳、醒神益智等功效，现代临床主要将其应用于治疗消化道疾病，如由于湿导致的胃痛、腹痛；以及神经系统疾病，如痰症导致的昏迷、健忘等症[2]。石菖蒲中含有挥发油类、黄酮类、醌类、生物碱类、三萜皂苷类、苯丙素类、有机酸类、氨基酸类及糖类等多种化合物，其中挥发油类为石菖蒲的主要有效成分，挥发油含量随种类和产地的不同而变化[3]。α-细辛醚和β-细辛醚作为挥发油中主要活性成分，发挥广泛且重要的药理作用[4]，挥发油类各化学成分占比详见图1。现今越来越多的研究已经证实它们在神经系统、心血管系统以及免疫系统中的显著作用[5]，尤其在抗神经系统疾病的研究中，α-和β-细辛醚已经引起国内外学者的高度重视。

α-和β-细辛醚二者互为同分异构体，分子式为C12H16O3，见图2。因其挥发油特性，α-和β-细辛醚能够快速通过血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)发挥药理活性[6]，研究表明它们对于神经系统疾病，如轻度认知功能障碍、抑郁症、帕金森病、癫痫和脑卒中等疾病均有潜在治疗优势[7-11]。本文主要对α-和β-细辛醚的神经系统药理作用及机制进行总述，重点探讨其在抗脑缺血再灌注损伤引起的级联反应中的潜在机制，作用机制详见表1。

图1 石菖蒲挥发油类化学成分比例图Fig.1 Proportion of chemical components of volatile oils注：Flavonoids(黄酮类)；Alkaloids(生物碱类)；Aminoacids(氨基酸类)；Triterpenoid saponins(三萜皂苷类)；Saccharides(糖类)；Volatile oils(挥发油类)；γ-Asarone(γ-细辛醚)；β-Caryophyllene(β-石竹烯)；Methyleugenol(甲基丁香酚)；β-Pinene(β-蒎烯)。

图2 α-细辛醚和β-细辛醚的化学结构Fig.2 Chemical structures of α-asarone and β-asarone

1 对轻度认知功能障碍的作用

轻度认知功能障碍(mild cognitive impairment)是机体正常衰老和痴呆之间的过渡阶段，临床表现伴随有轻微但可检测到的认知功能损伤。脑内胆碱能系统损害、氧化应激、兴奋性神经毒性以及突触与神经元的退化等众多因素，均能够引起机体轻度认知功能障碍[12]。中草药用于治疗认知功能障碍近年来得到越来越多研究，其中石菖蒲作为益智方配伍中的基础药物，其有效成分α-细辛醚和β-细辛醚已成为研究热点。

在对慢性铅暴露引起的大鼠认知障碍的研究中，β-细辛醚能迅速通过血脑屏障，明显提高大鼠海马CA1区和齿状回区树突棘密度，对铅诱导的空间学习记忆障碍有一定的神经保护作用[13]。对于胆碱能系统损害以及海马内Aβ沉积引起的认知障碍，Deng等[14]发现β-细辛醚能够同时降低APP/PS1转基因小鼠海马体中乙酰胆碱酯酶(AChE)和Aβ42水平，也有研究认为β-细辛醚可通过保护星形胶质细胞缓解Aβ沉积，也能够通过调节氧化应激及相关蛋白表达从而改善认知障碍[15,16]。虽然相对于β-细辛醚，α-细辛醚在学习记忆领域的研究不多，但早在2002年，Cho等[17]在体外实验中发现，它能够通过阻断N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受体活性，抑制大鼠皮层神经元谷氨酸所致的兴奋性毒性，从而产生抗氧化和神经保护作用；并且在最新的研究[18]中这一作用机制得到印证，本课题组的前期研究结果证实α-细辛醚(15、30 mg/kg，i.p.)能够降低小鼠海马体内钙超载，通过调节谷氨酸相关受体蛋白的异常表达，包括α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionicacid，AMPA)受体、谷氨酸转运体-1(glutamate transporter 1，GLT-1)及NMDA受体，降低谷氨酸蓄积过多引起的兴奋性神经毒性，从而改善乙醇诱导的认知功能障碍小鼠的学习记忆行为表现。

2 对抑郁症的作用

抑郁症(depression disorder)是一种持续而严重的精神疾病，其临床表现以精神低落为主，并伴有焦躁不安、活力丧失以及注意力减退等症状，严重者会出现自残及自杀行为。抑郁症在2020年取代冠心病，成为世界第二大负担疾病[19]。在世界自杀人群中，抑郁症患者已占到了三分之二，预估到2030年，抑郁症将成为全球最大的死亡原因[20,21]。抑郁症作为一种多因素疾病，其发病机制主要有炎症假说、谷氨酸神经递质异常假说、神经营养因子假说以及下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴异常假说等[22-25]。

研究证实[25]低剂量石菖蒲提取精油对小鼠自主活动不具有显著影响，并且在此前提下，它们能够调节去甲肾上腺素能与5-羟色胺能系统，改变抑郁模型小鼠在悬尾实验中的行为表现，产生一定的抗抑郁样效应。同样，Wang等[27]通过评价石菖蒲超临界萃取物，证实在萃取物药液的作用下，抑郁模型大鼠的抑郁样行为症状也得到不同程度的改善。β-细辛醚能够显著增加慢性不可预知温和应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)诱发的抑郁症大鼠糖水消耗量；并且在悬尾行为测试中，β-细辛醚组与CUMS模型组大鼠相比，悬尾静止时间降低了29%(P< 0.05)。除改善抑郁样行为之外，他们通过对大鼠海马CREB-ERK1/2-BDNF蛋白水平的测定，结果显示CREB、ERK1/2磷酸化水平及BDNF水平均显著增加，RT-PCR实验结果与WB结果相一致，所以β-细辛醚改善CUMS大鼠体重降低、缺氧以及明显的抑郁样行为，可能的机制是通过调节神经元的存活表现出抗抑郁作用[28]。同样，有研究[29]发现α-细辛醚也能够通过调节抑郁小鼠海马p-CREB水平能够减轻抑郁样行为。不过Chellian等[30]研究发现α-细辛醚能使小鼠在悬尾实验中能够激发双向作用，即在较低剂量(15和20 mg/kg，i.p.)出现抗抑郁样作用，在相对较高剂量(50和100 mg/kg，i.p.)下则出现了抑郁样行为。他们提示低剂量α-细辛醚的抗抑郁作用可能是通过调节去甲肾上腺素能(α1和α2肾上腺素受体)和5-羟色胺能系统(特别是5-HT1A受体)介导。调节5-羟色胺能系统是现今治疗抑郁症药物的主要作用机理，α-细辛醚能够调节5-羟色胺能系统的研究结论，以及β-细辛醚对抑郁样行为的显著改善作用，这意味着α-和β-细辛醚可以作为改善抑郁症的潜在化合物开发并值得进一步研究。

3 对帕金森病的作用

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种与年龄相关的常见于中老年人的中枢神经系统退行性疾病，以静息性震颤、运动迟缓、痴呆、步态紊乱和姿势不稳为主要临床表现[31]。帕金森病病因复杂，尚无统一明确的发病机制，但多数研究认为与氧化应激、炎性反应相关[32,33]。帕金森病主要的病理改变特征是黑质多巴胺(DA)能神经元变性缺失以及α-突触核蛋白(α-synuclein)沉积。

早在1965年Dandiya等[34]通过观察大鼠行为，提出细辛醚预处理能够完全消除tremorine(三尖杉碱，一种毒蕈碱激动剂)引起的帕金森病样症状，如头部和四肢震颤、肌力低下和肌肉僵硬，认为可将细辛醚作为抗帕金森药物进一步研究并探讨其作用机制。近年来，Huang等[35-38]于2014年至2017年丰富了β-细辛醚抗帕金森病的作用机制。起初，通过β-细辛醚与Levodopa(左旋多巴，帕金森治疗药物)联合用药发现，β-细辛醚能够通过调节DA降解酶(catechol-O-methyltransferase，COMT)活性和多巴胺(DA)代谢而影响左旋多巴向DA的转化[35]；后来发现β-细辛醚能够下调自噬相关蛋白Beclin-1和LC3B表达，增加P62蛋白表达来发挥作用[36]；另外他们还认为β-细辛醚够通过调节血脑屏障P-糖蛋白和紧密连接蛋白，促进左旋多巴进入脑内，提高大鼠纹状体多巴胺水平[37]。总之，β-细辛醚作用效果是积极的，它能通过提高血脑屏障通透性，下调自噬相关蛋白对帕金森病起到辅助治疗作用。Zhang等[39]以MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶)诱导的PD小鼠模型和体外培养的SH-SY5Y细胞为模型，观察β-细辛醚对PD的影响，认为β-细辛醚通过调节肺腺癌转移相关转录1(MALAT 1)和α-synuclein的表达，在体内和体外PD模型中发挥神经保护作用。同样，Kim等[40]通过将α-细辛醚作用于MPTP诱导的PD小鼠模型以及以脂多糖(LPS)刺激的BV-2小胶质细胞模型，发现α-细辛醚能减轻帕金森病小鼠行为缺陷，并认为可能机制是通过抑制NF-κB而减轻小胶质细胞介导的神经炎症实现的。

4 对癫痫的作用

癫痫(epilepsy)是大脑神经元突发性异常放电，导致短暂的大脑功能障碍以中枢神经系统功能失常为特征的一种慢性疾病。即刻早期基因c-fos作为神经功能活动的代谢产物，c-fos基因及FOS蛋白的表达被认为在癫痫发病机制中有重要作用[41]。此外，癫痫被认为是脑内兴奋性神经递质谷氨酸(glutamate，Glu)与抑制性神经递质γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)平衡失调的结果，谷氨酸脱羧酶(GAD)是Glu脱羧形成GABA的关键限速酶，GAD的活性对该平衡状态也有主要作用[42]。Fu等[43]通过β-细辛醚作用于青霉素点燃致癫痫大鼠，发现β-细辛醚能激活大鼠额叶皮质中c-fos基因从而明显提高FOS的表达，还能够降低谷氨酸脱羧酶GAD 65的表达，并且呈明显的剂量-效应关系。在化学作用(N-甲基-D-天门冬氨酸、毛果芸香碱)和电作用(最大电休克)诱导癫痫试验中[44]，α-细辛醚能够延缓阵挛和强直性发作，降低试验小鼠死亡率。α-细辛醚还能够通过增强GABA能抑制作用而抑制海马神经元的活动，并在中枢神经系统产生抗癫痫作用[45]，上文有研究也提到α-细辛醚能够对小鼠海马内Glu水平产生一定的影响[18]，可以认为α-细辛醚能够调节脑内兴奋性神经递质与抑制性神经递质，维持二者平衡水平。所以，He等[46]认为α-细辛醚具有较好的神经保护作用和低毒性，有望成为一种新的芳香烯丙醇类抗惊厥药物，作为抗癫痫药物具有很大的开发潜力。

表1 α-细辛醚和β-细辛醚抗神经系统疾病作用机制Table 1 Mechanism of α-asarone and β-asarone anti-nervous system diseases

续表1(Continued Tab.1)

续表1(Continued Tab.1)

5 对脑缺血再灌注损伤的作用

脑卒中(cerebral stroke)，包括出血性卒中(脑出血)和缺血性卒中(脑梗死)，其中缺血性卒中占比约85%[47]。急性缺血性脑卒中的治疗方法可分为溶栓治疗和神经保护治疗两大类[48]。目前，溶栓治疗药物重组人组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)是FDA获批临床用于治疗急性缺血性脑卒中、深静脉血栓及其他血管疾病的药物[49]。由于急性缺血性脑卒中本身是一种复杂的生理病理破坏性疾病，缺血后再灌注会引起缺血组织的继发性损伤和功能障碍，造成更加严重的病理反应[50]。所以近年来，国内外研究偏向于寻找神经保护治疗方法及机制探讨。传统开窍药石菖蒲作为天然药物，其活性物质α-和β-细辛醚在缺血再灌注损伤中发挥的显著作用得到了国内外研究的重视。

α-和β-细辛醚凭借其挥发油特性，能够从血液快速透过血脑屏障入脑，作用于缺血部位。研究证实[51-54]，α-细辛醚、β-细辛醚均能够降低大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大/小鼠脑组织含水量，减轻脑水肿，减少梗死面积，降低动物死亡率以及改善神经行为学评分，对脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion，I/R)小鼠起保护作用。在体外实验中[50,53]，也发现α-和β-细辛醚能够改善氧糖剥夺/复糖复氧(oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)导致的细胞凋亡与死亡，对海马神经元细胞、星形胶质细胞均有保护作用。由于α-和β-细辛醚在改善缺血再灌注损伤相关研究有限，下文所述主要通过现已明确的改善机制与α-和β-细辛醚在急性缺血性脑卒中各级联反应中的潜在机制结合进行讨论。

5.1 通过缓解能量代谢及离子代谢障碍发挥作用

脑最为代谢最为活跃的器官，自身能量和氧储备量最少，所以脑对缺血、缺氧损伤极为敏感[55]。脑缺血后，脑组织氧糖缺乏并引发能量代谢障碍，依靠ATP转运的离子泵活性因能量障碍受到抑制，同时因为钾泵、钙泵活性降低，使大量K+，Ca2+内流，由于渗透压作用，大量水被摄入从而导致脑水肿。研究[56]证实β-细辛醚能够提高I/R小鼠的耐缺氧能力，增加耐缺氧死亡时间。线粒体作为为机体提供能量的来源，在缺血再灌注损伤发生时，线粒体能量代谢异常。经过β-细辛醚处理OGD/R的原代海马神经元，JNK磷酸化水平降低，神经元线粒体内细胞色素C(Cyt C)趋于正常，从而降低caspase级联反应诱导的细胞凋亡，对损伤海马神经元起到了很好的保护作用[57]。当脑内ATP逐渐耗竭，能量代谢障碍会直接抑制细胞膜上Na+-K+-ATP酶活性，同时使神经元去极化，电压依赖性与配体门控性Ca2+通道激活，造成大量Ca2+内流。Ca2+水平紊乱又可以影响线粒体内ATP生成障碍，形成恶循环，进一步加重损伤。研究[50]发现β-细辛醚作用的I/R大鼠，其海马体中的Na+-K+-ATP酶活性显著升高，并且在体外实验[58,52]中也发现，β-细辛醚可以降低PC12细胞Ca2+水平以及降低线粒体膜电位，通过调节离子通道改善细胞损伤。

5.2 通过降低兴奋性毒性发挥作用

Ca2+水平的升高会刺激突触素蛋白释放过多谷氨酸，引起谷氨酸受体过度活化，使神经元过度兴奋，从而导致神经元溃变、死亡[18]。NMAD受体作为谷氨酸离子型受体，β-细辛醚能够调节NMDA受体的表达，增强突触素(SYN)在细胞内的表达，对谷氨酸损伤的PC12细胞有一定的保护作用[59]。另一项动物实验[18]发现，α-细辛醚也能够改善中枢神经系统兴奋性毒性引起的神经疾病，它能够调节Ca2+浓度，对谷氨酸受体(AMPA、NMDA)、转运体GLT-1以及控制释放谷氨酸的突触素蛋白(SYN Ⅰ)来维持谷氨酸的浓度。谷氨酸作为引起兴奋性神经毒性的主要神经递质，在认知功能障碍、癫痫这两类神经系统疾病中也有关键影响，所以α-细辛醚与β-细辛醚的降低兴奋性毒性的作用，具有广泛的应用领域及研究价值。

5.3 通过降低自由基氧化应激发挥作用

脑缺血时，抗氧化防御系统活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)蓄积过多，攻击机体，参与抗氧化的内源性酶，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase，CAT)等引起缺血部位氧化应激[60]。有研究者[61]表示再灌注后脑内抗氧化稳态的恢复可能有助于脑缺血损伤的恢复。Yang等[51]首先通过对缺血再灌注损伤小鼠神经功能缺损评分以及握力的行为学测试，发现β-细辛醚能够对损伤大鼠行为表现起到显著的改善作用。其次他们通过测定内源性抗氧化酶乳酸脱氢酶(LDH)、谷胱甘肽(GSH)含量、GSH-Px活性、谷胱甘肽还原酶(GR)活性、CAT以及Na+-K+-ATP酶来评估氧化应激，发现β-细辛醚能够使各酶水平均明显恢复。可见β-细辛醚通过增加与病变发病相关的抗氧化活性，从而增强脑缺血防御机制。Manikandan等[62]通过研究α-细辛醚对噪音引起的大鼠脑内抗氧化酶的影响，发现α-细辛醚能调节模型大鼠SOD、CAT、GSH-Px、GSH、维生素C、维生素E和蛋白质硫醇含量高低而起到有效的保护作用。

5.4 通过抑制炎性因子的表达发挥作用

氧自由基和其他信使激活炎性细胞因子，释放趋化因子，上调黏附分子，在白细胞和内皮细胞的相互作用下，白细胞黏附于血管内皮细胞，从而阻塞微血管，导致微血管闭塞而引发“无复流现象”[63]。炎性反应作为一把双刃剑，在病理条件下，炎性因子在协调天然和获得性免疫反应中起关键作用，其引起的炎性反应对机体稳态起着保护性效应，同时过度的炎性反应又能够损伤机体[64]。脑缺血时，氧自由基累积，炎性反应增加，激活的白细胞在微血管内聚集，释放大量的炎性介质和细胞因子，使更多的中性粒细胞聚集到炎性反应部位，从而加重炎症反应，造成恶性循环[65]。Chang等[66]通过研究SH-SY5Y细胞炎性反应及自噬作用，发现β-细辛醚可抑制炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的产生，保护细胞免受Aβ25-35诱导的炎性反应。α-细辛醚是一种很有前途的神经保护剂，可以用于预防和治疗小胶质细胞介导的神经炎症状态，因为有研究[67]在体内/体外实验中发现，α-细辛醚能够阻断NF-κB激酶即IκB-α和β(inhibitor kappa B-α，β)在SE大鼠和原代培养细胞中的降解途径，调节NF-κB转录水平，抑制小胶质细胞介导的神经炎症。Xu等[68]的研究结论与该研究结果相一致，另外他们认为α-细辛醚减轻炎症是通过抑制NF-κB信号通路减少了炎性因子TNF-α、IL-1β的产生。

5.5 通过保护血脑屏障发挥作用及其他作用

上述各级联反应的作用下，特别是在炎性反应中聚集的白细胞能够释放氧自由基、蛋白水解酶等直接损伤脑毛细血管内皮细胞，破坏血脑屏障。血脑屏障作为保持脑组织内环境稳定的重要屏障，中枢神经系统疾病常引起其结构与功能的变化。病理状态下，血脑屏障的内皮细胞间紧密连接开放，使得屏障的通透性增加，从而产生脑水肿造成神经元损伤，导致脑组织严重破坏。有观点[69]认为，若降低血脑屏障通透性，阻止大分子物质通过血脑屏障，将能够保护血脑屏障，改善脑缺血再灌注损伤。虽然已有研究[70]证实石菖蒲及石菖蒲挥发油成分能够保护血脑屏障，降低脑缺血再灌注损伤，但也有结果[71,37]表明α-与β-细辛醚能使内皮细胞皱缩，紧密连接疏松，从而增加血脑屏障的通透性，辅助药物进入脑组织，这与上述研究机制相矛盾。所以，α-和β-细辛醚对于血脑屏障是否具有保护作用还需要进一步研究来证实。

除此之外，α-和β-细辛醚在扩张血管以及抗血栓中也发挥重要作用。有研究表明β-细辛醚和α-细辛醚都能够抗血小板聚集[72,73]。另外，内皮素、去甲肾上腺素(NE)、降钙素基因相关肽(CGRP)等作为调节血管的收缩与舒张的重要因子，β-细辛醚能降低内皮素含量，升高CGRP表达[74]，降低NE含量[75]。总之，α-和β-细辛醚可以通过扩张血管，降低病理条件下血小板聚集，从而使血管平滑肌舒张，改善组织血液供应，起到一定的抗血栓作用。

6 讨论与展望

石菖蒲挥发油主要成分α-和β-细辛醚的药理作用广泛，由于其高脂溶性，它们极易通过血脑屏障分布于脑组织，在神经系统疾病方面展示了广泛药理活性。近年来，国内外学者对于α-和β-细辛醚作用机制进行了系统的研究，证实了它们具有抗认知功能障碍、抗抑郁、抗帕金森、抗癫痫和抗缺血性脑卒中的显著作用。临床已将α-细辛醚用于支气管哮喘、慢性支气炎、肺炎及其它呼吸道疾病的治疗，其抗血小板和抗血栓作用也在冠心病、心肌梗死以及肺栓塞的治疗中发挥了优势[76]。此外，β-细辛醚通过诱导癌细胞凋亡，对结肠癌、直肠癌显示出有效的抗肿瘤活性[77]。然而，对α-和β-细辛醚开发与应用还需要解决一系列问题。首先，α-和β-细辛醚虽然具有吸收快、分布快的特点，但它们的口服生物利用度低，血浆中药物消除的速度快，半衰期短；其次，β-细辛醚在机体内约22%可转变为α-细辛醚(顺式结构转变为反式结构)，使得β-细辛醚的药理作用变得不明确；另外，毒理学研究表明，α-和β-细辛醚具有致突变性、遗传毒性和致畸性，临床应用具有一定风险[78,79]。因此，可以对α-和β-细辛醚进行一定的化学结构修饰来提高药物的稳定性，改善α-和β-细辛醚的代谢过程，从而提高生物利用度；对其用药安全及用药剂量进行进一步评价，提高药物作用的安全性和有效性；并且，还需要对现今有关α-和β-细辛醚致肝癌与抗癌的不同观点进行进一步研究。总之，继续深入开展对石菖蒲挥发油主要成分α-和β-细辛醚药理活性等方面的研究将具有重要意义。