云木香根茎中的倍半萜类成分研究

周 颖，杨 孔，吴 涛，李海舟，冯 阳，许 敏

昆明理工大学生命科学与技术学院制药工程技术中心，昆明 650500

肝癌是全世界第五大最常见的和高致死率的癌症[1]。在肝癌中，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占原发性肝癌的85%～90%，是导致死亡的第二大常见原因，每年有70万人死亡。乙型肝炎(hepatitis B virus，HBV)或丙型肝炎(hepatitis C virus，HCV)病毒的慢性感染、慢性肝病、酗酒以及饮食致癌物质，如黄曲霉毒素等是导致HCC的主要诱因[2]。据估计，亚洲和非洲的发病率最高[2]。目前没有能有效治疗HCC的药物[2]。天然产物及其衍生物或是模拟天然产物及其药效团的药物是抗肿瘤药物发现的重要源泉。其中，倍半萜类分子不仅骨架类型多样，而且具有显着的抗肿瘤活性[3]。因此，倍半萜的研究一直是天然产物化学非常重要和活跃的领域。

云木香(SaussurealappaC.B Clarke)隶属于菊科(Compositae)风毛菊属(Saussurea)。原产地为印度东北部。上世纪四十年代中期逐步替代进口，成为云南地道药材之一，称为“云木香”。云木香始载于《神农本草经》，列为上品[4]。根据文献报道云木香含有丰富的倍半萜(如愈创木烷型和吉玛烷型倍半萜)类化合物。其中，去氢木香内酯和木香烃内酯为其主要的倍半萜类成分。云木香具有抗病毒，抗炎，抗菌，抗肿瘤，调节免疫，促进血管生成，解痉镇痛，调理肠胃，抗胃溃疡，利胆，调控中枢神经系统(CNS)，抗氧化，抗寄生虫，昆虫拒食以及调节植物生长等生物活性。其中，木香烃内酯和去氢木香内酯显示显着的抗乙肝病毒活性[5]。此外，有文献报道木香烃内酯以剂量和时间依赖性的方式有效抑制了肝癌细胞(HepG2)的增殖[6]。但是，未见开展云木香中倍半萜抑制肝癌细胞活性的系统研究。因此，基于我们长期系统开展倍半萜类化学成分及其生物活性的研究[7-9]，本文对产自云南丽江云木香的根茎部位进行了倍半萜类成分及其抑制肝癌细胞的研究，以期发现具有抗肝癌的天然活性分子。

1 材料与方法

1.1 材料

正相色谱采用的材料有80～100、200～300和500～800目硅胶(青岛海洋化工厂)；反相材料采用的材料有：Diaion HP20SS(Mitsubishi Chemical Corportion,Tokyo Japan)；ODS-A(40～63 μm,日本)；MCI-gel-CHP-20P(75～150 μm,Mitsubishi Chemical Corportion,Tokyo Japan)。TLC采用G型(青岛海洋化工厂)，显色剂为10% H2SO4-EtOH溶液和碘化铋钾显色剂，均匀喷洒后加热至显色。

Bruker DRX-600核磁共振波谱仪(Bruker BioSpin group，Germany)；Agilent 1260/6530 B液质联用仪(安捷伦公司，美国)；分析型液相色谱仪Waters 2695/2996(Waters公司，美国)；制备型液相色谱仪Waters 1525/2998(Waters公司，美国)。

N-1100旋转蒸发仪(东京理化器械株式会社)；A-1000S真空泵(东京理化器械株式会社)；CA-1111冷却水循环装置(东京理化器械株式会社)；AL204电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；SK-2200HP超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；ZF-1型三用紫外分析仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；多功能酶标仪(Infinite M200 Pro，瑞士TECAN公司)。

实验所用云木香于2018年5月采于中国云南省丽江，由贵州中医药大学吴之坤博士鉴定为云木香(SaussurealappaC.B Clarke)的干燥根。植物标本保存于昆明理工大学生科楼天然药物化学生物学实验室，标本编号为KUMST-BS-0007。

1.2 实验方法

1.2.1 提取和分离

取干燥的云木香根茎部分(119.0 kg)，粉碎之后用纯甲醇在室温下冷浸提取4次，每次用20 L甲醇，浸泡24 h，合并提取液，浓缩得到浸膏11.4 kg。浸膏加水稀释至50 L，悬浮于水中，用乙酸乙酯萃取5次，合并滤液，减压浓缩后得到乙酸乙酯萃取物4.5 kg(得率：39.5%)和水层4.6 kg(得率：40.4%)。

水层用适量水溶解，用大孔树脂Diaion HP20SS(20.0 cm×80.0 cm)柱层析，以甲醇-水(0%、50%、55%、60%、70%、100%)为流动相进行梯度洗脱，然后经薄层色谱TLC检测，合并相同流分，将水层划分为4个部分：ZY-1(69.4 g)、ZY-2(137.6 g)、ZY-3(171.6 g)和ZY-4(16.0 g)。ZY-3(171.6 g)用MCI反相树脂(10.0 cm×36.0 cm)柱层析，以甲醇-水(0%→100%)梯度洗脱，然后经薄层色谱TLC检测，合并相同流分，得到7个部分：ZY3-1～ZY3-7。ZY3-3(49.5 g)用ODS-A(4.5 cm×40.0 cm)柱层析，以甲醇-水(35%→100%)梯度洗脱，然后经薄层色谱TLC检测，合并相同流分，得到6个部分：ZY3-3-1～ZY3-3-6。ZY3-3-3(16.5 g)分别用200～300目硅胶(5.0 cm×30.0 cm)柱层析，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，然后经硅胶柱(3.0 cm×18.0 cm)柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(35∶1→5∶1)梯度洗脱，然后经薄层色谱TLC检测，合并相同流分，得到16个部分：ZY3-3-3-1-1～ZY3-3-3-1-16。ZY3-3-3-1-6(63.3 mg)用硅胶(1.2 cm×20.0 cm)柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(4∶1)等度洗脱，得到化合物2(4.5 mg)。ZY3-3-3-7(3.3 g)再分别用氨基硅胶(3.0 cm×30.0 cm)柱层析，以二氯甲烷-甲醇(10∶1→3∶1)梯度洗脱，ODS-A(3 cm×40.0 cm)柱层析，以甲醇-水(30%→100%)梯度洗脱，再通过HPLC半制备(20 %乙腈水)纯化得到化合物8(8 mg)。ZY3-3-3-7-5-3(24.6 mg)，用200～300目硅胶(1.2 cm×30.0 cm)柱层析以二氯甲烷-甲醇(6∶1→5∶1)梯度洗脱，得到化合物9(8.0 mg)。ZY-3-3-3-1-6(63.3 mg)用硅胶(1.5 cm×15.0 cm)柱层析，以石油醚/乙酸乙酯(20∶1→4∶1)梯度洗脱，得到化合物6(8.7 mg)。ZY3-3-3-8(1.3 g)用ODS-A(3 cm×40.0 cm)柱层析，以甲醇-水(10%→100%)梯度洗脱，用200～300目硅胶(1.5 cm×25 cm)柱层析，以二氯甲烷-甲醇(13∶1→4∶1)梯度洗脱，再用薄层色谱制备得到化合物7(1.2 mg)。

ZY-4(16.0 g)经200～300目硅胶柱(4.5 cm×40.0 cm)柱层析，环己烷-乙酸乙酯(25∶1→5∶1)梯度洗脱，再经200～300目硅胶柱层析，环己烷-乙酸乙酯梯度洗脱和羧基硅胶硅胶柱层析，环己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，得到化合物4(6.2 mg)、化合物5(2.2 mg)和化合物3(465.8 mg)。ZY4-4(5.2 g)反复经200～300目硅胶柱柱层析，环己烷-乙酸乙酯梯度洗脱和羧基硅胶柱柱层析，环己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，得到化合物1(950.6 mg)。

1.2.2 细胞毒活性测试

用含10%胎牛血清的培养液(DMEM)配成单个细胞悬液，以每孔3 000～15 000个细胞接种到96孔板，每孔体积100 (L，贴壁细胞提前12～24 h接种培养。待测化合物用DMSO溶解，30 μM为浓度初筛。37 ℃培养24 h后，贴壁细胞弃孔内培养液，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT(噻唑喃)溶液37 ℃孵育4 h，然后每孔加入150 μL DMSO(二甲基亚砜)避光震摇12 min，并且用多功能酶标仪读取于490 nm处检测96孔板的OD值，记录结果。顺铂(DDP)为阳性对照化合物。最后按如下公式进行数据处理(公式1)。

抑制率=[(空白组平均OD值-实验组

OD值)/空白组平均OD值]×100%

2 结果

2.1 结构鉴定

化合物1白色晶体(CHCl3)；ESI-MS：m/z231 [M+H]+，253 [M+Na]+；分子式为C15H18O2；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.23(1H，d，J=3.5 Hz，H-13a)，5.50(1H，d，J=3.1 Hz，H-13b)，5.28(1H，d，J=2.1 Hz，H-15a)，5.08(1H，d，J=1.9 Hz，H-15b)，4.90(1H，s，H-14a)，4.82(1H，s，H-14b)，3.97(1H，t，J=9.3 Hz，H-6)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：30.3(C-1)，36.3(C-2)，149.2(C-3)，52.0(C-4)，85.3(C-5)，47.6(C-6)，30.9(C-7)，32.6(C-8)，139.7(C-9)，45.1(C-10)，151.3(C-11)，170.3(C-12)，120.3(C-13)，109.6(C-14)，112.6(C-15)。以上数据与文献[10]对照基本一致，故鉴定为去氢木香内酯。

化合物2棕色油状物(CHCl3)；ESI-MS：m/z271 [M+Na]+；分子式为C15H20O3；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.40(1H，d，J=2.0 Hz，H-15a)，5.31(1H，d，J=2.1 Hz，H-15b)，4.98(1H，s，H-14a)，4.94(1H，s，H-14b)，4.03(1H，t，J=9.7 Hz，H-1)，1.24(3H，d，J=7.0 Hz，Me-13)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：43.9(C-1)，39.2(C-2)，74.0(C-3)，153.7(C-4)，51.3(C-5)，84.2(C-6)，50.0(C-7)，32.8(C-8)，36.5(C-9)，149.3(C-10)，42.5(C-11)，179.0(C-12)，13.6(C-13)，111.5(C-14)，114.0(C-15)。以上数据与文献[11]对照基本一致，故鉴定为sausinlactone A。

化合物3白色晶体(CHCl3)；ESI-MS：m/z271 [M+K]+，487 [2M+Na]+；分子式为C15H20O2；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.27(1H，d，J=3.6 Hz，H-13a)，5.53(1H，d，J=3.6 Hz，H-13b)，4.85(1H，ddt，J=11.5，4.7，1.5 Hz，H-1)，4.74(1H，d，J=9.9 Hz，H-5)，4.58(1H，dd，J=9.8，8.8 Hz，H-6)，1.71(3H，s，Me-14)，1.43(3H，s，Me-15)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：127.0(C-1)，28.0(C-2)，41.0(C-3)，140.0(C-4)，127.0(C-5)，81.9(C-6)，50.4(C-7)，26.2(C-8)，39.4(C-9)，137.0(C-10)，141.5(C-11)，170.5(C-12)，119.7(C-13)，16.1(C-14)，17.4(C-15)。以上数据与文献[12]对照基本一致，故鉴定为木香烃内脂。

化合物4白色晶体(CHCl3)；ESI-MS：m/z233 [M+H]+；分子式为C15H20O2；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.06(1H，d，J=3.2 Hz，H-13a)，5.39(1H，d，J=3.1 Hz，H-13b)，5.38(1H，s，H-3)，3.88(1H，t，J=11.0 Hz，H-6()，1.84(3H，s，Me-15)，0.92(3H，s，Me-14)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：39.9(C-1)，23.6(C-2)，123.2(C-3)，133.8(C-4)，51.9(C-5)，83.0(C-6)，51.9(C-7)，22.2(C-8)，38.5(C-9)，36.7(C-10)，140.1(C-11)，171.8(C-12)，117.2(C-13)，18.1(C-14)，24.4(C-15)。以上数据与文献[13]对照基本一致，故鉴定为α-环木香烃内酯。

化合物 5白色针状晶体(CHCl3)；ESI-MS：m/z233 [M+H]+；分子式为C15H22O2；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.31(1H，s，H-13a)，5.68(1H，s，H-13b)，4.71(1H，d，J=1.8 Hz，H-15a)，4.41(1H，d，J=1.8 Hz，H-15b)，0.73(3H，s，Me-14)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：42.00(C-1)，23.63(C-2)，41.21(C-3)，145.4(C-4)，50.0(C-5)，27.5(C-6)，39.5(C-7)，30.1(C-8)，37.0(C-9)，36.1(C-10)，150.9(C-11)，171.6(C-12)，124.9(C-13)，16.6(C-14)，105.7(C-15)。以上数据与文献[14]对照基本一致，故鉴定为β-木香酸。

化合物6白色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z271 [M+Na]+；分子式为C15H20O3；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.09(1H，d，J=3.2 Hz，H-13b)，5.42(1H，d，J=3.1 Hz，H-13a)，4.99(1H，d，J=1.0 Hz，H-15b)，4.86(1H，d，J=1.1 Hz，H-15a)，4.03(1H，t，J=10.9 Hz，H-6β)，3.53(1H，dd，J=11.5，4.5 Hz，H-1α)，0.81(3H，s，Me-14)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：78.3(C-1)，31.4(C-2)，33.7(C-3)，142.7(C-4)，53.1(C-5)，79.8(C-6)，49.7(C-7)，21.6(C-8)，35.8(C-9)，43.1(C-10)，139.6(C-11)，171.0(C-12)，117.4(C-13)，11.8(C-14)，110.8(C-15)。以上数据与文献[15]对照基本一致，故鉴定为reynosin。

化合物7白色晶体(CH3OH)；ESI-MS：m/z433 [M+Na]+；分子式为C21H30O8；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.14(1H，d，J=3.6 Hz，H-13a)，5.60(1H，d，J=3.3 Hz，H-13b)，4.59(1H，d，J=12.1，1.2 Hz，H-15a)，1.37(3H，s，Me-14)，4.26(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′-Glc)，3.94(1H，d，J=12.1 Hz，H-6a′-Glc)，3.83(1H，dd，J=11.9，1.6 Hz，H-6b′-Glc)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：127.7(C-1)，28.8(C-2)，42.2(C-3)，141.9(C-4)，131.3(C-5)，82.3(C-6)，51.9(C-7)，27.7(C-8)，36.7(C-9)，138.8(C-10)，142.3(C-11)，172.7(C-12)，120.4(C-13)，16.6(C-14)，68.6(C-15)，104.8(Glc C-1′)，75.3(Glc C-2′)，78.3(Glc C-4′)，71.8(Glc C-3′)，78.2(Glc C-5′)，62.9(Glc C-6′)。以上数据与文献[16]对照基本一致，故鉴定为picriside B。

化合物8白色晶体(吡啶和CH3OH)；ESI-MS：m/z348 [M+H]+，370 [M+Na]+；分子式为C20H29NO4；1H NMR(600 MHz，Pyridine-d5)δ：4.46(2H，m，H-6 and H-1)，4.58(1H，d，J=9.9 Hz，H-5)，1.09(3H，s，Me-14)，1.36(3H，s，Me-15)；13C NMR(150 MHz，Pyridine-d5)δ：126.5(C-1)，28.3(C-2)，39.3(C-3)，139.7(C-4)，128.3(C-5)，81.4(C-6)，48.5(C-7)，26.2(C-8)，40.9(C-9)，137.4(C-10)，47.5(C-11)，178.1(C-12)，51.8(C-13)，16.9(C-14)，15.9(C-15)，176.5(C-1′)，67.6(C-2′)，29.3(C-3′)，24.1(C-4′)，54.3(C-5′)。以上数据与文献[17]对照基本一致，故鉴定为saussureamine A。

化合物9白色粉末(吡啶和CH3OH)；ESI-MS：m/z346 [M+H]+；分子式为C20H27NO4；1H NMR(600 MHz，Pyridine-d5)δ：3.75(1H，t，J=9.6 Hz，H-6)，2.62(1H，t，J=8.9 Hz，H-11)，3.15(1H，dd，J=13.3，5.5 Hz，H-13a)，2.91(1H，d，J=13.2 Hz，H-13b)，4.46(1H，br s，H-14a)，4.58(1H，s，H-14b)，4.86(1H，overlap，H-15a)，5.15(1H，overlap，H2O，H-15b)；13C NMR(150 MHz，Pyridine-d5)δ：46.6(C-1)，32.5(C-2)，29.9(C-3)，152.6(C-4)，52.1(C-5)，85.4(C-6)，44.0(C-7)，29.2(C-8)，38.1(C-9)，150.6(C-10)，47.0(C-11)，177.7(C-12)，51.9(C-13)，108.3(C-14)，110.9(C-15)，176.2(C-1′)，67.3(C-2′)，32.4(C-3′)，23.9(C-4′)，54.0(C-5′)。以上数据与文献[17]对照基本一致，故鉴定为saussureamine B。

图1 云木香根茎中分离得到的化合物Fig.1 Chemical compounds from the S.lappa

2.2 抗肿瘤活性

本文测试了云木香根茎部分分离得到的倍半萜类化合物中不同结构类型的主要成分，其分别为化合物1、3、4、6、8和9。研究结果提示，在30 μM上述化合物对肝癌细胞株(HepG2)具有弱的抑制活性。其中，化合物3木香烃内酯对HepG2肝癌细胞株具有一定的细胞毒活性，其抑制率为60%(如表1所示)。

表1 化合物对HepG2的细胞毒活性Table 1 Cytotoxic activity on HepG2 cells

3 讨论与结论

天然产物分子结构多样性是寻找新药目标化学实体的源泉，有多达40%的治疗药物来源于传统药用植物等天然资源[18]。其中，倍半萜分子是一类广泛分布于生物体中骨架类型最多样最复杂的次生代谢产物，迄今为止已发现几千种倍半萜类化合物，涉及200多种骨架，无论是在数量上还是在骨架类型上均居萜类成分之首[19]。为此，倍半萜的研究一直是天然产物化学非常重要和活跃的领域。多数倍半萜分子不仅结构新颖而且具有显着的细胞毒活性。云木香为菊科风毛菊属植物，富含倍半萜类成分。前期研究发现其主要被倍半萜类成分木香烃内酯和去氢木香内酯是云木香中的主要活性成分之一，具有显着抗乙型肝炎病毒等生物活性[20]。此外，也有报道木香烃内酯对人骨肉瘤细胞(U2OS)、乳腺癌细胞(MCF-7)、膀胱癌细胞(T24)、白血病细胞(HL-60)、宫颈癌细胞(Hela)和肝癌细胞(HepG2)等多种癌症细胞的增殖具有显着的抑制作用[6]。但是，未见云木香中其他倍半萜类成分抗肝癌细胞增殖的研究报道。本论文从云南省丽江产云木香根茎部位分离鉴定了9个倍半萜类成分，骨架类型涉及愈创木烷型3个(化合物1、2和9)、桉叶烷型3个(化合物4～6)和吉玛烷型3个(化合物3、7和8)。其中，化合物8和9为较少见的倍半萜和氨基酸的杂合体。细胞毒活性测试提示化合物1、3、4、6、8和9在30 μM浓度时对肝癌细胞株(HepG2)具有弱的细胞毒活性。其中，化合物木香烃内酯(3)的抑制率为60%，该研究结果与文献报道结果基本一致[6]。此外，我们的研究结果提示，云木香中分离鉴定的倍半萜类分子中吉玛烷型类分子比愈创木烷型和桉叶烷型倍半萜类分子显示较强的肝癌细胞抑制活性。因此，非常有必要进一步对云木香中的吉玛烷型类的倍半萜类分子开展研究，为其在抑制肝癌细胞活性的构型关系研究提供参考，也为云木香药材的开发利用提供科学依据。

致谢:中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室分析测试中心和昆明理工大学生命科学与技术学院实验中心测试所有图谱。